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文檔簡介
1、目的:
隨著醫(yī)療檢測水平和人們健康知識水平的不斷提高,常染色體顯性多囊腎病(ADPKD),已經(jīng)逐漸被人們所熟知。這種最常見的單基因遺傳性腎病,其發(fā)病率之高,并發(fā)癥之重,給患者家庭和整個社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔。ADPKD的發(fā)病率約為1/400-1/1000,其病理特點是雙腎滿布大小不等、充滿囊液的液性囊泡,隨著病程的進展、囊液的不斷分泌和蓄積,囊泡不斷增大,同時壓迫臨近的正常腎組織,最終導致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的不可逆損傷。據(jù)統(tǒng)計,
2、ADPKD患者在60歲以后,約有一半以上的患者會進展到終末期腎病(ESRD)。ADPKD目前尚無有效的治療方法,病人進入ESRD后,主要的治療措施為透析治療包括血液透析,腹膜透析和腎臟移植治療。
目前認為ADPKD的致病基因主要包括兩個即多囊腎病基因1(PKD1)和多囊腎病基因2(PKD2)。PKD1和PKD2編碼的蛋白分別為多囊蛋白1(PC1)和多囊蛋白2(PC2),PC1和PC2在胞內(nèi)側(cè)通過C末端相互作用構(gòu)成復合體,起到陽
3、離子通道作用,通過感受機械壓力等各種刺激,從而調(diào)節(jié)細胞鈣離子的內(nèi)流,傳遞細胞信號。但是近幾年在臨床發(fā)現(xiàn)部分有ADPKD臨床表現(xiàn)的患者,卻沒有發(fā)現(xiàn)以上兩個基因位點的突變,提示我們可能存在pdk1和pkd2之外的致病基因。
因此本研究采用了新型mTOR抑制劑Y31來研究其對Han:SPRD多囊腎病大鼠的治療作用及可能作用機制。Y31由長征醫(yī)院腎內(nèi)科與中國科學院藥物研究所共同研發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn)其藥代動力學與水溶性等特性要明顯優(yōu)于Ra
4、pamycin,有可能成為新的治療ADPKD的有效藥物。
mTOR抑制劑對于mTOR的抑制作用已經(jīng)明確,而mTOR對于JAK-STAT1/3的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)有越來越多的研究,而本科室前期的研究表明,JAK-STAT1/3對于補體B因子(CFB)有正向調(diào)控作用,而CFB通過活化巨噬細胞等作用促進多囊腎病的發(fā)生發(fā)展也已經(jīng)被證實,因此我們考慮mTOR抑制劑可能會通過JAK-STAT1/3這一途徑影響補體B因子的表達,進而干預多囊腎病的
5、疾病進程,所以在本研究還會觀察mTOR抑制劑對于補體系統(tǒng)的影響。
傳統(tǒng)mTOR抑制劑在臨床試驗中未能取得令人滿意的效果,考慮其原因一方面為,相比動物實驗用藥,患者口服藥物劑量較小,另一方面的原因可能為mTOR被抑制后,其負反饋通路PI3K-AKT通路被激活,最終導致mTOR抑制不完全,治療效果不理想,此外傳統(tǒng)Rapamycin水溶性差導致腎臟局部藥物濃度偏低也可能是重要原因之一。因此本研究擬通過聯(lián)合用藥,多靶點治療,實現(xiàn)對多囊
6、腎病大鼠的有效治療。
二甲雙胍(Metformin),是目前治療2型糖尿病的一線降糖藥物,它是目前公認的AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)激動劑,AMPK活化后,可以通過直接或間接方式抑制mTOR,此外它還可以通過激活具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸梅活性的雙重特異性磷酸酶PTEN來抑制PI3K-AKT通路的激活,進而抑制mTOR的活化。因此本研究擬通過新型mTOR抑制劑Y31與Metformin的聯(lián)合用藥來實現(xiàn)多靶點治療。由于Me
7、tformin自身有mTOR抑制作用,因此聯(lián)合用藥可以減少mTOR抑制劑的使用劑量,進而可以減少mTOR抑制劑所帶來的感染等并發(fā)癥,同時Metformin具有激活PTEN進而抑制PI3K-AKT通路的作用,可以降低甚至阻斷抑制mTOR后所導致的負反饋通路激活。這樣聯(lián)合用藥治療多囊腎病的模式在ADPKD研究中尚屬首次,旨在通過本研究,為臨床治療ADPKD探索新的治療物藥及治療模式。
方法:
采用多囊腎病動物模型Han:
8、 SPRD多囊腎病大鼠和人腎囊腫襯里上皮細胞WT9-12細胞系,通過灌胃等給藥方式給藥,內(nèi)眥及心臟取血等方法取血檢測腎功能指標,來評價藥物的治療作用;使用western bloting,組織病理切片染色,MTT等實驗方法,檢測藥物對大鼠腎臟組織以及wT9-12細胞中mTOR通路相關(guān)蛋白p-p70s6k及mTOR負反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白分子p-AKT表達量的變化,檢測補體旁路途徑相關(guān)蛋白補體B因子(CFB)及補體C3降解片段表達量的變化,
9、觀察藥物對大鼠腎臟囊腫生長及細胞增殖的影響等以探討藥物的作用機制。
結(jié)果:
在第一部分動物實驗中,與多囊腎病對照組(Ctrl)相比,陽性對照藥物RAPA(1mg/kg)以及治療藥物Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以顯著降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重體重比、囊腫指數(shù)指標以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)給予Y312mg/kg組體重下降比較明顯,與Ctrl組相比有統(tǒng)計學差異。
在第二部分動
10、物實驗中,與多囊腎病對照組(Ctrl)相比,陽性對照藥物RAPA(0.5mg/kg和1mg/kg)以及治療藥物Metformin(150mg/kg)和Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重體重比以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)給予Y312mg/kg組體重下降比較明顯,與Ctrl組相比有統(tǒng)計學差異;與多囊腎病對照組(Ctrl)相比,聯(lián)合用藥組均可以降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重
11、體重比以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)MET150mg/kg聯(lián)合Y312mg/kg組體重下降比較明顯,與Ctrl組相比有統(tǒng)計學差異;但是聯(lián)合用藥未出現(xiàn)藥物的協(xié)同或者疊加效應,在腎功能血肌酐及尿素氮的保護方面,聯(lián)合用藥組明顯優(yōu)于相應的MET單藥,且肌酐和尿素氮的下降有統(tǒng)計學差異,但是與相應的mTOR抑制劑組相比肌酐和尿素氮的下降沒有統(tǒng)計學差異。
在第三部分動物實驗中,與多囊腎病對照組(Ctrl)相比,Metformin(250m
12、g/kg)單藥治療,Metformin與RAPA聯(lián)合用藥治療以及RAPA(0.5mg/kg)單藥治療均可顯著降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的血肌酐和尿素氮,聯(lián)合用藥組的治療效果要明顯優(yōu)于Metformin單藥,但是與RAPA單藥治療組相比,相應腎功能的改善并沒有統(tǒng)計學差異。
Western blotting結(jié)果顯示,Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)同RAPA(1mg/kg)一樣,可以顯著降低Han: SPRD多囊腎
13、病大鼠腎臟組織中mTOR通路下游蛋白p-p70s6k的表達量;而Y31(0.5mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以一定程度的增加Han: SPRD多囊腎病大鼠腎臟組織中mTOR負反饋調(diào)節(jié)通路中相關(guān)蛋白p-AKT的表達量,但是Y31(2mg/kg)卻能顯著降低p-AKT的表達量。
Western blotting方法結(jié)果顯示,Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以顯著降低Han:SPRD多囊
14、腎病大鼠腎臟組織中補體旁路途徑相關(guān)蛋白補體B因子(CFB)以及補體C3降解片段C3b和C3c的表達量。
免疫組化檢測顯示Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以顯著降低Han:SPRD多囊腎病大鼠腎臟組織切片中增殖細胞核抗原Ki-67陽性細胞數(shù)量。
MTT法檢測提示,在人腎囊腫襯里上皮細胞WT9-12細胞中給予不同藥物濃度的Y31后,可以抑制WT9-12細胞的細胞增殖率,且在一定范圍內(nèi)呈
15、線性關(guān)系。
Western blotting方法結(jié)果顯示,在人腎囊腫襯里上皮細胞WT9-12細胞中給予不同藥物濃度的Y31作用后,可顯著減少WT9-12細胞中mTOR通路下游蛋白p-P70s6k蛋白的表達量,并且高濃度的Y31(50uM)能顯著降低WT9-12細胞p-AKT的表達量。
Western blotting方法結(jié)果顯示,在人腎囊腫襯里上皮細胞WT9-12細胞中給予不同藥物濃度的Y31刺激后,可以顯著減少WT
16、9-12細胞中補體旁路途徑相關(guān)蛋白補體B因子(CFB)及補體C3降解片段C3c的表達量。
結(jié)論:
本研究首先在體內(nèi)動物實驗證實了新型mTOR抑制劑Y31同傳統(tǒng)的mTOR抑制劑具有同樣的抑制mTOR信號通路的作用,并且大劑量的Y31具有抑制mTOR負反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白p-AKT表達的作用。首次提出了mTOR抑制劑對于補體系統(tǒng)的抑制從而緩解多囊腎病大鼠疾病進展的新作用。然而本研究發(fā)現(xiàn),Metformin單藥雖然具有延
17、緩多囊腎病大鼠疾病進展的作用,但是與mTOR抑制劑聯(lián)合用藥后未出現(xiàn)聯(lián)合使用藥物的協(xié)同或者疊加作用。在體外細胞實驗中,亦證明了新型mTOR抑制劑Y31對于mTOR信號通路的抑制作用,高濃度的Y31同樣顯示了對于p-AKT表達的抑制作用,在細胞實驗中也再次驗證了其對于補體系統(tǒng)的抑制作用。因此,通過體內(nèi)和體外實驗研究,證實了新型mTOR抑制劑Y31可以通過抑制mTOR信號通路及補體系統(tǒng)、大劑量的Y31尚可抑制mTOR負反饋通路中關(guān)鍵蛋白p-A
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