水稻鈣依賴型蛋白激酶OsCPK9的抗逆功能研究.pdf

1、干旱、極端溫度、病害以及日益嚴(yán)重的土地鹽漬化等逆境造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)，研究植物抗性分子機(jī)理是提高植物對(duì)逆境適應(yīng)性進(jìn)而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)的基礎(chǔ)。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了精細(xì)的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)協(xié)調(diào)自身的發(fā)育進(jìn)程，以適應(yīng)環(huán)境變化。Ca2+作為第二信使在植物生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。外界刺激引起的植物相關(guān)生化生理反應(yīng)大多數(shù)與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。鈣依賴型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPK）是鈣

2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要感受器與效應(yīng)器之一。研究表明，CDPK與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝及各種逆境生理過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，但其作用的分子機(jī)理仍不十分清楚。
　　水稻(Oryza sativa L.)作為最重要的糧食作物之一，為世界上近一半人口提供每日所需的蛋白質(zhì)和熱量。我國(guó)水稻種植面積占全國(guó)糧食作物的四分之一，水稻的生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)關(guān)系著國(guó)計(jì)民生。雖然在水稻基因組中已鑒定出31個(gè)CDPKs基因，但目前僅有少數(shù)幾個(gè)水稻CDPKs的功能得以闡

3、明，而有關(guān)OsCPK9基因的功能還未見(jiàn)報(bào)道。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，OsCPK9基因受干旱和稻瘟病侵染誘導(dǎo)，暗示OsCPK9在響應(yīng)干旱和稻瘟病侵染過(guò)程中具有重要作用。本研究旨在探索水稻OsCPK9基因?qū)Ω珊得{迫和稻瘟病侵染響應(yīng)的的生理和分子機(jī)制。這將為培育具有抗性的水稻新品種提供理論依據(jù)。本研究首先分析了水稻模式品種日本晴（O.sativa L.cv Nipponbare）中OsCPK9基因與其它物種進(jìn)化上的關(guān)系，并克隆了OsCPK9基因；在

4、此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用遺傳學(xué)、生理學(xué)及生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法研究了OsCPK9響應(yīng)干旱脅迫和稻瘟病侵染中的作用，主要研究結(jié)果如下：
　　1)利用RT-PCR技術(shù)獲得了OsCPK9基因的全長(zhǎng)cDNA序列，該基因的ORF為1725bp，編碼一個(gè)由574個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。OsCPK9所編碼蛋白具有CDPK家族蛋白所具有的典型保守結(jié)構(gòu)域及活性區(qū)域。
　　2)器官差異表達(dá)分析表明，OsCPK9基因在營(yíng)養(yǎng)器官葉和莖中表達(dá)量最高

5、，在生殖器官花藥、小穗中表達(dá)量較高，在根中表達(dá)量最低； OsCPK9基因的表達(dá)能夠顯著被滲透脅迫、鹽和脫落酸（ABA）誘導(dǎo)。
　　3) PLANTCARE在線分析顯示，OsCPK9基因啟動(dòng)子OsCPK9p序列含有多個(gè)與逆境和信號(hào)物質(zhì)相關(guān)的順式表達(dá)元件；將克隆到的2kbOsCPK9p取代pBI121中的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成OsCPK9p與GUS的融合表達(dá)載體,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法在煙草不同組織中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，OsC

6、PK9p啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在不同組織中都有不同程度的表達(dá)；另外，通過(guò)農(nóng)桿菌滲入法將OsCPK9p::GUS導(dǎo)入煙草葉片，分析發(fā)現(xiàn)OsCPK9p驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)受滲透脅迫和ABA處理上調(diào)。
　　4)過(guò)表達(dá)OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因水稻可顯著提高對(duì)干旱、滲透和脫水脅迫的耐受性，發(fā)現(xiàn)OsCPK9正調(diào)控對(duì)干旱的耐性是通過(guò)增加氣孔關(guān)閉和滲透調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的；此外，過(guò)表達(dá)OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)脫落酸更加敏感，而OsCPK9基因干擾的

7、轉(zhuǎn)基因植株對(duì)脫落酸的敏感性則無(wú)明顯變化。
　　5)采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了上述轉(zhuǎn)基因植株在正常條件下、ABA和滲透脅迫處理后ABA/脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常條件下與對(duì)照相比，OsNAC9在過(guò)表達(dá)OsCPK9的轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量較高，而OsCPK9基因干擾轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量較低；OsLEA3、Rab21、OsRSUS和OsP5CS在過(guò)表達(dá)OsCPK9基因轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)有顯著的上升。ABA處理后，Rab21、O

8、sbzip66、OsNAC45和OsRSUS在過(guò)表達(dá)OsCPK9基因轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)顯著上升，但在OsCPK9基因干擾轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)降低。Osbzip23、OsLEA3、OsP5CS、OsNAC9和Osbzip72在過(guò)表達(dá)OsCPK9基因轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)有顯著上升。滲透脅迫處理下，除 OsNAC6和OsNAC45外，其它所有選擇的基因在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中均上調(diào)。這些結(jié)果表明OsCPK9可能參與了ABA信號(hào)的傳導(dǎo)途徑，通過(guò)調(diào)控脅迫

9、相關(guān)基因的表達(dá)而增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性。
　　6)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟期小穗的分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株與對(duì)照相比，小穗育性和穗重顯著提高，與此相反，OsCPK9基因干擾株系與對(duì)照相比，小穗育性出現(xiàn)了不同程度的下降。碘-碘化鉀染色測(cè)定結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株與對(duì)照相比，具有較高的花粉染色率，而OsCPK9基因干擾株系與對(duì)照相比，具有較低的花粉染色率，推測(cè)OsCPK9可能通過(guò)影響

10、淀粉累積提高花粉活力，進(jìn)而增加水稻植株的小穗育性和穗重。
　　7)利用半定量 RT-PCR方法，分析了稻瘟病不同抗性材料在水楊酸（salicylic acid，SA）和稻瘟病接種下的OsCPK9基因和抗病防御相關(guān)基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，OsCPK9基因較早地響應(yīng)稻瘟病病原菌的侵染，并可能參與了SA介導(dǎo)的抗病防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑；此外還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)OsCPK9基因增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病的抗性，抑制OsCPK9基因的表達(dá)則會(huì)減弱其抗性。

11、r>　　8)構(gòu)建了35S::OsCPK9-GFP、OsCPK9p::OsCPK9-GFP、OsCPK9組成型激活突變體和GFP的融合蛋白植物表達(dá)載體35S::oscpk9-GFP和OsCPK9p::oscpk9-GFP，將這些質(zhì)粒和空載體對(duì)照轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞、煙草表皮細(xì)胞及水稻原生質(zhì)體細(xì)胞當(dāng)中，結(jié)果顯示，OsCPK9-GFP融合蛋白定位在葉綠體中。組成型激活的突變體-GFP則定位在質(zhì)膜和葉綠體上。
　　綜上所述，OsCPK9通過(guò)