鹽脅迫誘導(dǎo)水稻根尖細胞質(zhì)膜蛋白差異表達及LRR型受體蛋白激酶的功能研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文鹽脅迫誘導(dǎo)水稻根尖細胞質(zhì)膜蛋白差異表達及LRR型受體蛋白激酶的功能研究姓名：程彥偉申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張煒20081201博l j 學(xué)位論義 鹽脅迫誘導(dǎo)水稻根犬細胞質(zhì)膜生[ J 差異表達及L R R 型受體蛋[ 』激酶的功．口c ．。k ，p - f 究k i n a s e ，h y p e r s e n s i t i v e —i n d u c e d r e s p

2、o n s ep r o t e i n ，1 4 —3 ·3 l i k ep r o t e i n 和c y t o c h r o m e b 5 ) ，3種蛋白轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平變化不一致( C a l m o d u l i n ，p u t a t i v e a l p h a - s o l u b l eN S Fa t t a c h m e n tp r o t e i n 和p u t a t i v

3、 e Y L P ) 。研究結(jié)果表明高等植物中基因表達存在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的差異，推測這種差異和m R N A 、蛋白質(zhì)各自的修飾及穩(wěn)定性有關(guān)。2 ．水稻L R R 型受體蛋白激酶胞外區(qū)的原核表達、抗體制備和生物功能分析上述組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一個新的水稻L R R 型受體蛋白激酶O s R P K l 。O s R P K l 蛋白利用S M A R T 軟件分析其保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白含有一個跨膜域，N 端存在信號肽，胞外區(qū)具有6 個亮氨酸

4、拉鏈富集區(qū)( L R R ) ；C 端含有蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域。O s R P K I和水稻O s R L K l 、O s L R K l 、O s B R l l 、O s X a 2 1 、擬南芥A t R P K l 、玉米Z m R L K 和胡蘿卜D c P S K R 等植物中的L R R 型受體蛋白激酶序列同源性分別2 5 ．3 1 ％、2 2 ．7 ％、2 1 ．3 ％、2 3 ．0 7 ％、2 2 ．6 8 ％、2 0

5、 ．4 7 ％和2 5 ．0 5 ％。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析表明O s R P K l 和玉米中Z m R L K 同源關(guān)系較近。為了進一步研究該激酶的生理功能，利用D N A S t a rP r o t e a n 軟件對水稻受體激酶O s R P K l 的抗原指數(shù)分布進行了分析，選擇抗原性和特異性均較高的A a1 5 4 ．3 5 0 片段作為抗原，通過反轉(zhuǎn)錄P C R 得到c D N A 片段，并亞克隆至p E T 2 9 a 原

6、核表達載體，在大腸桿菌B L 2 1 中實現(xiàn)了高表達，表達量約為細胞總蛋白的3 0 ％。重組蛋白經(jīng)S D S —P A G E 分離，染色切膠收集后，作為抗原免疫新西蘭家兔，分離抗血清，經(jīng)純化和W e s t e r nb l o t 檢測，得到1 ：2 0 0 0 0 效價的多克隆抗體。該抗體能特異識別在原核表達系統(tǒng)內(nèi)表達的抗原，以及水稻根尖細胞質(zhì)膜組分中的L R R 型受體蛋白激酶。利用該制備抗體通過免疫電鏡直接驗證了O s R P

7、 K l 的亞細胞定位是細胞質(zhì)膜。通過w e s t e r nb l o t 研究了鹽、干旱、冷和A B A 等非生物脅迫條件下O s R P K l 的表達情況，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫1 2 hO s R P K l 的表達顯著上調(diào)，至脅迫4 8 h 表達仍維持在較高的水平，O s R P K l免疫組化分析進一步證實了上述結(jié)果；干旱脅迫3 h 和1 2 h O s R P K l 的表達顯著上調(diào)，4 8 h 后又恢復(fù)到正常水平；O s R P