鈣-鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ-,δ-基因敲除對(duì)心臟觸發(fā)活動(dòng)的影響及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、心臟異常電觸發(fā)活動(dòng)誘發(fā)的致命性心律失常是導(dǎo)致心衰患者發(fā)生心源性猝死（Sudden cardiac death，SCD）的主要原因。CaMKⅡ在心衰時(shí)的高表達(dá)狀態(tài)及其相關(guān)的鈣調(diào)控機(jī)制異常與心臟觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 在心衰等交感興奮的疾病狀態(tài)下，鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）對(duì)ⅠCa-L和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等電觸發(fā)活動(dòng)相關(guān)機(jī)制起主要調(diào)控作用。急性抑制CaMKⅡ活性可以有效改善心衰細(xì)胞鈣活動(dòng)，減少心臟觸發(fā)活動(dòng)。但是，CaM

2、KⅡ活性長(zhǎng)期抑制后，可能會(huì)因?yàn)橄嚓P(guān)蛋白表達(dá)和功能水平變化而造成不同結(jié)果。
　　 基于上述研究和理論，我們選用CaMKⅡδ基因敲除小鼠為研究對(duì)象，分別研究了正常狀態(tài)和心衰狀態(tài)下，長(zhǎng)期維持心臟CaMKⅡ的低活性狀態(tài)對(duì)心肌細(xì)胞電觸發(fā)活動(dòng)的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 第一部分鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱδ基因敲除對(duì)心臟觸發(fā)活動(dòng)的影響之一——正心肌細(xì)胞的研究
　　 目的：研究長(zhǎng)期降低CaMKⅡ活性后對(duì)正常心肌細(xì)胞電觸

3、發(fā)活動(dòng)的變化及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：以CaMKⅡδ基因敲除(KO)小鼠為研究對(duì)象。分離單個(gè)心肌細(xì)胞后，用CaMKⅡ活性試劑盒鑒定心肌細(xì)胞CaMKⅡ活性變化。用心肌細(xì)胞牽張偶聯(lián)模型評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞早期后除極(EAD)誘發(fā)情況。用膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞ⅠCa-L、ⅠNCX的變化。用鈣通道阻斷劑Nifedipine和含Ba2+灌流液，評(píng)價(jià)鈣電流和鈉鈣交換體電流增加在EAD發(fā)生中的作用。以Fura-2為細(xì)胞Ca2+指示劑，用細(xì)胞鈣成像系

4、統(tǒng)檢測(cè)心肌細(xì)胞鈣瞬變和肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平。Western blot分析CaMKⅡ、鈣通道蛋白Cav1.2和NCX蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：生理狀態(tài)下CaMKⅡ活性降低后，CaMKⅡδ-KO和正常WT心肌細(xì)胞EAD誘發(fā)率分別為94％(30/32)和13％(4/30，p<0.05)，誘發(fā)KO心肌細(xì)胞EAD所需的牽張水平(Gsac)顯著低于WT心肌細(xì)胞（3.4±0.4 ns vs.7.6±0.9 ns，p<0.05）。KO心肌細(xì)胞的

5、鈣電流（-7.2±0.3 pA/pF vs.-6.2±0.2 pA/pF,p<0.05）和鈉鈣交換體電流強(qiáng)度（-0.52±0.11 pA/pF vs.-0.30±0.06 pA/pF,p<0.05）顯著高于WT心肌細(xì)胞；其相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平也顯著高。進(jìn)一步用鈣通道阻斷劑Nifedipine可以完全抑制KO心肌細(xì)胞EAD的發(fā)生。用含Ba2+外液灌流，對(duì)KO心肌細(xì)胞的EAD誘發(fā)情況并不造成影響。心肌細(xì)胞鈣成像結(jié)果顯示，KO和WT心肌細(xì)胞的舒

6、張期鈣濃度和鈣瞬變幅度無明顯差異；而KO心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平顯著較WT心肌細(xì)胞降低(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)適當(dāng)?shù)腃aMKⅡ生理活性水平對(duì)維特心肌細(xì)胞電活動(dòng)的平衡起到重要作用。(2)長(zhǎng)期過度降低CaMKⅡ活性會(huì)引起正常心肌細(xì)胞L型鈣通道、NCX蛋白上調(diào)以及相應(yīng)電流強(qiáng)度增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞電不穩(wěn)定性增加。
　　 第二部分鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱδ基因敲除對(duì)心臟觸發(fā)活動(dòng)的影響之二——心衰心肌細(xì)胞的研究

7、　　 目的：觀察長(zhǎng)期維持CaMKⅡ低活性狀態(tài)下，心衰心肌細(xì)胞電觸發(fā)活動(dòng)的變化及其相關(guān)機(jī)制
　　 方法：用主動(dòng)脈縮窄方法制作KO和WT小鼠心衰模型，4周后用心超評(píng)價(jià)心功能狀態(tài)，選取EF值<50％的心衰小鼠作為研究對(duì)象。分離單個(gè)心肌細(xì)胞后，用CaMKⅡ活性試劑盒鑒定心肌細(xì)胞CaMKⅡ活性變化。采用心肌細(xì)胞牽張偶聯(lián)模型比較CaMKⅡδ-KO小鼠和對(duì)照組WT小鼠發(fā)生心衰后心肌細(xì)胞的EAD誘發(fā)情況。用膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞Ⅰca-L、Ⅰ

8、NCX。并用細(xì)胞鈣成像系統(tǒng)檢測(cè)心肌細(xì)胞鈣瞬變和肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平。Western blot分析CaMKⅡ、鈣通道蛋白Cavl.2和NCX蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：心衰狀態(tài)下，KO心衰(KO-HF)心肌細(xì)胞的CaMKⅡ活性降低顯著低于對(duì)照組心衰(WT-HF)心肌細(xì)胞。KO-HF心肌細(xì)胞EAD誘發(fā)率(50％，7/14)顯著低于WT-HF心肌細(xì)胞分別為(84.2％，16/19;p<0.05)。KO-HF心肌細(xì)胞誘發(fā)EAD所需的牽張水

9、平(Gsac)較WT-HF心肌細(xì)胞顯著提高（15.7±2.1 ns vs.7.2±0.5ns，p<0.05）。KO-HF心肌細(xì)胞的Ⅰca-L的電流峰值較WT-HF心肌細(xì)胞顯著降低（-5.3±0.3 pA/pF和-7.0±0.3 pA/pF，p<0.05）；而鈣通道蛋白Cav1.2的表達(dá)無變化。KO-HF心肌細(xì)胞INCX的內(nèi)向電流強(qiáng)度較WT-HF心肌細(xì)胞顯著降低（-0.37±0.06pA/pF vs.-0.65±0.14 pA/pF,p<

10、0.05），且相應(yīng)的NCX蛋白表達(dá)水平也低于WT-HF細(xì)胞。心肌細(xì)胞鈣成像結(jié)果顯示，KO-HF和WT-HF心肌細(xì)胞的舒張期鈣濃度和鈣瞬變幅度無明顯差異；而KO-HF心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平顯著低于WT-HF心肌細(xì)胞(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)在CaMKII表達(dá)增高的心衰狀態(tài)下，長(zhǎng)期維持心臟CaMKⅡ低活性狀態(tài)可以有效減少心衰心肌細(xì)胞的異常電觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生。(2)在心衰狀態(tài)下，長(zhǎng)期維持心臟CaMKⅡ的低活性水平可以減少