PKA-鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ?qū)Ξ惐I上腺素誘導(dǎo)的延遲后除極和觸發(fā)活動(dòng)的作用.pdf

1、背景:蛋白激酶A(PKA)和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)作為β-腎上腺素受體下游的磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能磷酸化心肌細(xì)胞內(nèi)多種鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起著非常重要的作用。近年來(lái)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及正常動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)，與PKA途徑相比較，CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是β-腎上腺素誘導(dǎo)的舒張期鈣離子滲漏所導(dǎo)致的觸發(fā)活動(dòng)中主要的信號(hào)途徑。但CaMKⅡ和PKA在蘭尼丁受體RyR2 功能紊亂所致的舒張期肌漿網(wǎng)鈣離子滲漏的作用仍存在很大爭(zhēng)議，其

2、所導(dǎo)致的直接電生理作用仍不清楚。
　　 目的:研究β-腎上腺素刺激及增加肌漿網(wǎng)鈣釋放通道蘭尼丁受體RyR2 開(kāi)放的頻率在延遲后除極(DADs)和觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生中的作用，探討DADs和觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生的頻率依賴性。探討PKA 特異性抑制劑H89和CaMKⅡ特異性抑制劑KN-93對(duì)異丙腎上腺素和咖啡因誘導(dǎo)的DADs和觸發(fā)活動(dòng)的影響。
　　 方法:酶解法分離家兔心室肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄動(dòng)作電位(AP)，采用含1μmol/

3、L 異丙腎上腺素和0.3mmol/L咖啡因的正鈣臺(tái)氏液灌流心室肌細(xì)胞，在快頻率(1～3Hz)電刺激下，觀察心肌細(xì)胞靜息膜電位及90[％]動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)，并誘發(fā)出DADs和觸發(fā)活動(dòng)。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)該用H89(1μmol/L)、KN-93(1μmol/L)和KN-92(1μmol/L)進(jìn)行灌流，觀察H89、KN-93和KN-92對(duì)DADs和觸發(fā)活動(dòng)誘發(fā)率，以及他們對(duì)DADs的幅值、誘發(fā)個(gè)數(shù)和聯(lián)律間期的影響。
　　 結(jié)果:

4、
　　 1、對(duì)照組、ISO組、ISO+CAFFEINE組心肌細(xì)胞靜息膜電位無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 ISO組、ISO+CAFFEINE組APD90較對(duì)照組明顯縮短(P<0.05)。
　　 2、給予細(xì)胞3Hz電刺激，對(duì)照組、ISO組、ISO+CAFFEINE組DADs的發(fā)生率分別為7/20、15/20、18/20，觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生率分別為0/20、3/20、6/20。ISO組、ISO+CAFFEINE組與對(duì)

5、照組比較DADs的發(fā)生率均明顯增加(P<0.05)，ISO組和ISO+CAFFEINE組比較DADs的發(fā)生率無(wú)明顯差別(P>0.05)。對(duì)照組和ISO組比較觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生率無(wú)明顯差別(P>0.05)，而ISO+CAFFEINE組與對(duì)照組比較觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生率明顯增加(P<0.05)。
　　 3、在1μmol/L 異丙腎上腺素和0.3mmol/L 咖啡因的正鈣臺(tái)氏液灌流下，分別給予細(xì)胞1-3Hz電刺激，家兔單個(gè)心室肌細(xì)胞DADs的發(fā)

6、生率分別為13/20、13/20、18/20，觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生率分別為2/20、3/20、6/20。1Hz組與2Hz組比較DADs和觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生率均無(wú)明顯差別(P>0.0125)；1Hz組與3Hz組比較DADs和觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生率均明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125)。
　　 4、在持續(xù)異丙腎上腺素、咖啡因灌流和高頻刺激(3Hz)下，觀察到KN-93組和KN-92組DADs的誘發(fā)率分別為8/20、18/20；觸發(fā)活動(dòng)的誘發(fā)率分別

7、為6/20、19/20。KN-93組DADs和觸發(fā)活動(dòng)的誘發(fā)率較KN-92組明顯降低(P<0.05)。另外，與KN-92 比較，KN-93 還能明顯降低DADs的幅度，使DADs的幅度從7.89 mV 降至1.66 mV(P<0.001)；能顯著減少DADs的誘發(fā)個(gè)數(shù)(0.75±0.65vesus 4.44±1.33，P<0.05)；能顯著延長(zhǎng)DADs的聯(lián)律間期(623.8±89.2 ms vesus 489.0±33.2 ms，ves

8、us KN-92，P<0.05)。
　　 5、在灌流1μmol/L 異丙腎上腺素和0.3mmol/L 咖啡因的正鈣臺(tái)氏液條件下，觀察到H-89組DADs的誘發(fā)率為7/20，觸發(fā)活動(dòng)的誘發(fā)率為3/20。H-89組DADs和觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生率均較加藥前明顯降低(P<0.05)。H-89 還能使DADs的幅度從8.66 mV 降至1.9 mV(P<0.001)，減少DADs的誘發(fā)個(gè)數(shù)(與ISO+CAFFEINE組比較，1.4±0.46ve

9、sus 3.89±1.19,P<0.05)，顯著延長(zhǎng)DADs的聯(lián)律間期(與ISO+CAFFEINE組比較，638.9±146.1ms vesus 503.9±127.5ms，P<0.05)。
　　 結(jié)論:肌漿網(wǎng)鈣儲(chǔ)備的增加及肌漿網(wǎng)鈣釋放通道蘭尼丁受體功能的紊亂是誘發(fā)DADs和觸發(fā)活動(dòng)的兩個(gè)不可或缺的條件，且其誘發(fā)率具有頻率依賴性。PKA 特異性抑制劑H89和CaMKⅡ特異性抑制劑KN-93均能有效抑制異丙腎上腺素和咖啡因誘導(dǎo)的D