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文檔簡介
1、目的:
PINCH-1(Particulary Interesting New Cysteine- Histicline rich protein)蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關基質以及粘附分子密切相關的蛋白,由5個LIM(含有Lin-11, Isl-1and Mec-3蛋白的結構域)結構以及一個C′端構成。目前國內外關于PINCH-1在白血病骨髓造血微環(huán)境中的表達及其作用方面的研究尚未見報道。本課題擬從此角度入手,探討P
2、INCH-1蛋白在白血病骨髓基質的表達水平與分布情況,并通過特異性阻斷PINCH-1的表達后,觀察拮抗PINCH-1表達后Bim,ILK等相關蛋白表達的變化情況,同時觀察骨髓基質細胞增殖的變化情況。本實驗通過上述的綜合研究,探討PINCH-1在白血病骨髓基質細胞中的變化及其與白血病細胞相互作用的可能改變,為探索從新的角度治療白血病提供理論依據(jù)。
材料和方法:
1.白血病骨髓基質細胞PINCH-1的表達與分布<
3、br> 收集15例急性髓細胞白血病患者、17例急性淋巴細胞白血病患者(均為初發(fā)白血病患者)和30例正常對照的骨髓基質細胞。
(1)培養(yǎng)正常和急性白血病患者的骨髓基質細胞;
(2)應用RT-PCR法,檢測正常和急性白血病骨髓基質細胞中PINCH-1的mRNA表達;
(3)Western blot法檢測PINCH-1蛋白在正常和急性白血病骨髓基質細胞中的表達,免疫熒光和免疫組織化學檢測PINC
4、H-1在骨髓基質細胞中的分布。
2. RNAi阻抑骨髓基質細胞PINCH-1的表達
收集初發(fā)急性白血病患者(急淋4例、急非淋2例)骨髓標本6例。
(1)培養(yǎng)急性白血病骨髓基質細胞;
(2)構建以針對PINCH-1的慢病毒為載體的RNA干擾片段;
(3)以慢病毒為載體RNAi沉默PINCH-1的表達;
(4)RT-PCR檢測RNAi干預骨髓基質細胞前后急性
5、白血病骨髓基質細胞PINCH-1mRNA表達的變化;
(5)Western blot法檢測RNAi沉默PINCH-1前后急性白血病骨髓基質細胞PINCH-1、Bim、ILK蛋白表達的變化;
(6)MTT法檢測RNAi沉默PINCH-1前后急性白血病骨髓基質細胞的增殖情況的變化。
結果:
1.急性白血病骨髓基質細胞PINCH-1表達明顯高于正常骨髓基質細胞:在急性淋巴細胞白血病和急性
6、非淋巴細胞白血病患者骨髓基質細胞中,PINCH-1在mRNA水毛和蛋白水平均比正常骨髓基質細胞增高((P<0.01);急性淋巴白血病PINCH-1蛋白的表達明顯高于急性非淋巴細胞白血病(P<0.01),但mRNA表達無明顯差別;
2.免疫細胞化學和免疫熒光顯示,在骨髓基質細胞中PINCH-1蛋白主要在細胞漿表達,細胞核則未見明顯表達;
3.成功構建慢病毒為載體的RNA干擾片段;
4.以慢病毒為載
7、體RNAi沉默了骨髓基質細胞中PINCH-1的表達,沉默后:(1)PINCH-1的表達在RNA和蛋白水平均明顯降低;(2)BIM蛋白表達升高;(3)ILK蛋白則表達降低;(4)阻抑后白血病骨髓基質細胞增殖活性明顯降低。
結論:
1.白血病骨髓基質細胞存在PINCH-1的高表達;
2.PINCH-1可能通過與ILK形成的穩(wěn)態(tài)結構參與了白血病骨髓基質細胞的粘附功能的調節(jié);
3.PINC
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