TGF-β對白血病細(xì)胞株Gli1、Gli2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 Hedgehog(HH)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于胚胎發(fā)育不同組織及時期,是胚胎發(fā)育過程中的主要調(diào)節(jié)信號通路之一,在組織的損傷與修復(fù)中發(fā)揮著開啟正常干細(xì)胞自我更新的功能。但HH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活卻可誘使正常干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌干細(xì)胞,最終導(dǎo)致癌的發(fā)生。眾多研究表明該通路與包括白血病在內(nèi)的多種腫瘤性疾病相關(guān),因此抑制該通路有可能成為腫瘤預(yù)防和治療的新靶點。
　　 Gli作為轉(zhuǎn)錄因子,是刪信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最后一個環(huán)節(jié),其

2、下游基因包括多種與細(xì)胞增生分化相關(guān)的基因,可能是該通路導(dǎo)致腫瘤的關(guān)鍵因素。這些基因包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和分化的基因,維持細(xì)胞生長的基因,促進(jìn)細(xì)胞自我更新的基因,血管生成相關(guān)基因,上皮基質(zhì)轉(zhuǎn)化基因和侵襲基因。這些均提示該通路的活化可能不僅和腫瘤的發(fā)生相關(guān),還與腫瘤的復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移相關(guān)。Gli分子本身與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展并沒有直接關(guān)系,但直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的分子基因轉(zhuǎn)錄水平則受到HH信號通路調(diào)控。
　　 最近的研究傾向于其他途

3、徑對Gli的非經(jīng)典激活,發(fā)現(xiàn)在有的腫瘤中存在由TGF-β信號通路介導(dǎo)的Gli的非經(jīng)典激活。TGF-β作為細(xì)胞因子,對白血病細(xì)胞可以有一系列的影響,包括抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化、改變粘附分子和細(xì)胞因子受體表達(dá),以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。TGF-β1在TGFβ家系中發(fā)現(xiàn)最早,且生物活性最強(qiáng),在造血調(diào)控方面起重要作用。
　　 那么,在白血病中是否同樣存在tGF-β信號通路對Gli的調(diào)控作用呢?本研究應(yīng)用TGF-β作用于白血病HL-60和u93

4、7細(xì)胞株,檢測HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表達(dá)的變化,并檢測tNF-α以及SIS3對HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表達(dá)的影響,從而證明在白血病HL-60和U937細(xì)胞株中同樣存在TGF-β信號通路對Gli的調(diào)控作用,為白血病發(fā)病機(jī)制的完善提供新的思路,為白血病的治療提供新的靶點。
　　 方法：
　　 1、TGF-β對HL-60和U937細(xì)胞株Gli1、G1i2表達(dá)的影響
　　 (1)

5、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60和U937細(xì)胞24h、48h和72h后,MTT法檢測HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的增殖情況。(2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞72h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。(3)用0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞,時間分別為6h、12h、24h。處理

6、結(jié)束后收集細(xì)胞,提取mRNA,檢測Gli1和Gli2的表達(dá)。(4)5ng/ml TGF-β1、5ng/ml TGF-β1+5μM SIS3分別作用于U937細(xì)胞24h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,提取mRNA和蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達(dá)。(5)PCR反應(yīng)判定HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞是否表達(dá)Ptch和Smo基因。(6)5μM SIS3作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞,時間分別為6h、12h、24h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,提取mRNA和

7、蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達(dá)。(7)對照組細(xì)胞在不含任何處理因素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。(8)ELISA法分別檢測正常人血清、HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1水平.
　　 2、TGF-β和TNF-α協(xié)同作用于HL-60和U937細(xì)胞株對Gli1、Gli2表達(dá)的影響
　　 (1)5ng/mlTNF-α和0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60

8、細(xì)胞和U937細(xì)胞24h、48h和72h,MTT法檢測HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的增殖情況。(2)5ng/mlTNF-α+5ng/mlTGF-β1作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞72h,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。(3)5ng/mlTNF-α作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞24h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,提取蛋白,檢測TGF-βR I和TGF-β RⅡ蛋白表達(dá)。(4)5ng/mlTNF-α作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞,作用時間分

9、別為12h、24h、48h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,提取mRNA,檢測Gli1和Gli2的表達(dá)。(5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分別作用于HL-60細(xì)胞24h;5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分別

10、作用于U937細(xì)胞24h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,提取mRNA和蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達(dá)。(6)對照組細(xì)胞在不含任何處理因素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：
　　 1、TGF-β對HL-60和U937細(xì)胞株Gli1、Gli2表達(dá)的影響
　　 (1)0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60細(xì)胞24h、48h和72h,對HL-60細(xì)胞的增殖沒有明顯影

11、響:1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于U937細(xì)胞24h、48h和72h,U937細(xì)胞的增殖受到抑制,并且隨時間的延長抑制更加顯著。
　　 (2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞72h,U937細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分比明顯增加,而HL-60細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分比沒有明顯變化。
　　 (3)0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlTGF-β1分別作用于HL-60細(xì)胞6h、12h、24h

12、,各組間及其與對照組間比較,Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)沒有明顯差異。
　　 0.1ng/mlTGF-β1作用于U937細(xì)胞6h、12h、24h,與對照組比較Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)沒有明顯差異;1ng/mlTGF-β1和10ng/mlTGF-β1分別作用于U937細(xì)胞6h、12h、24h,從12h起并至少持續(xù)至24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)較對照組明顯減少;而1ng/mlTGF-β1組和10ng/mlT

13、GF-β1組,其組間比較Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)沒有明顯差異。
　　 (4)5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3分別作用于U937細(xì)胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表達(dá)與對照組比較:5ng/mlTGF-β1組較對照組降低,而5ng/mlTGF-β1+5μ M SIS3組較對照組明顯增高。
　　 (5)HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞不表達(dá)Ptch和Smo基因。
　　

14、 (6)5μ M SIS3分別作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞6h、12h、24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)與對照組比較:Gli1、Gli2表達(dá)較對照組明顯增高;并且隨著作用時間的延長,差異更加顯著。
　　 (7)HL-60和U937細(xì)胞的培養(yǎng)上清TGF-β1水平明顯低于正常人。
　　 2、TGF-β和TNF-α協(xié)同作用于HL-60和U937細(xì)胞株對Gli1、Gli2表達(dá)的影響
　　 (1

15、)在TNF-α的協(xié)同作用下1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞24h、48h和72h,HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的增殖均受到抑制,并且隨時間延長抑制更加顯著。
　　 (2)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α作用于HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞72h,HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比均明顯增加.
　　 (3)5ng/mlTNF-α分別作用于HL-60細(xì)胞和U

16、937細(xì)胞24h,各組與對照組間比較,TGF-β R I和TGF-β RⅡ蛋白表達(dá)較對照組增高。
　　 (4)5ng/mlTRF-α分別作用于HL-60細(xì)胞和0937細(xì)胞12h、24h、48h,各組間及其與對照組間比較,Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)沒有明顯差異。
　　 (5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μM SIS3分別作用于HL-60細(xì)胞24

17、h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表達(dá)各組間及其與對照組間比較:5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組較對照組降低,而5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3組則較對照組升高。
　　 5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3分別作用于U937

18、細(xì)胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)各組間及其與對照組間比較:5ng/mlTGF-B1組、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組均較對照組降低;5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組較5ng/mlTGF-β1組更低;5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3組和5ng/mlTGF-β1+5ng/m1TNF-α+5μ MSIS3組均較對照組增高。
　　 結(jié)論：
　　 1、單獨應(yīng)用

19、TGF-β可以降低U937細(xì)胞Gli1、Gli2的表達(dá),對HL-60細(xì)胞Gli1、Gli2的表達(dá)則沒有影響;TGF-β降低U937細(xì)胞Gli1、Gli2的表達(dá)是通過TGF-β/Smad3途徑介導(dǎo)的,可被SIS3所抑制,不依賴于Ptch/Smo途徑;HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞分泌的TGF-β可能降低Gli1、Gli2的表達(dá)。
　　 2、TNF-α可以增加HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞TGF-βRⅠ和TGF-β RⅡ蛋白表達(dá)。TNF