逆轉錄病毒介導法將SV40LT基因導入中國對蝦淋巴細胞的初步研究.pdf

1、近年來由于對蝦病害的威脅，對蝦養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展受到了嚴重的影響。為了深入研究對蝦病毒和發(fā)展有效的疾病防治策略，建立對蝦細胞系的要求日益迫切。本文采用逆轉錄病毒介導的方法將細胞轉化基因-猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)導入培養(yǎng)的中國對蝦(Penaeus Chinensis)淋巴細胞(lymphoid cells)中，嘗試對其進行轉化培養(yǎng)。本研究旨在探索對蝦細胞體外培養(yǎng)的可行技術，為對蝦細胞的建系工作奠定基礎。 從攜帶SV40LT

2、基因的質粒pLLTSN中高保真PCR擴增出2.1 Kb的SV40LT基因，將其插入到泛嗜性逆轉錄病毒載體(pantropic retroviral vector)pLXRN的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ位點之間，構建重組載體pLXRN-SV40LT。酶切分析和測序驗證結果表明，載體插入基因的位置、大小、序列均正確，成功構建重組泛嗜性逆轉錄病毒表達載體pLXRN-SV40LT。 采用磷酸鈣沉淀法將重組載體pLXRN-SV40LT與包裝

3、質粒pVSV-G共轉染GP2-293細胞，病毒包裝48小時后收集上清。經NIH3T3細胞測定，重組病毒的滴度為4×10<'6>cfu/ml。 以重組病毒感染原代培養(yǎng)的中國對蝦淋巴細胞，經G418篩選陽性細胞后傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)結果表明，轉基因細胞株具有貼壁能力下降，從壁上脫落的細胞可懸浮生長等轉化細胞的特征，傳至10代時，其生長狀態(tài)和分裂勢頭仍很好，而對照細胞只能傳至3代；轉基因細胞株傳至12代時因真菌污染而丟失。 PC

4、R法檢測第10代轉基因細胞株基因組中的SV40LT基因，結果表明成功擴增出270 bp SV40LT片段，證實轉基因細胞株基因組中較穩(wěn)定的含有SV40LT基因；采用端粒重復序列擴增法(TRAP)分析轉基因細胞株的端粒酶活性，聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，轉基因細胞株的端粒酶活性明顯高于原代對照細胞，這從一個側面反映了轉基因對蝦細胞株獲得了轉化的特性。 本研究有希望發(fā)展成為建立對蝦永生化細胞系的可行技術，同時為探索其他海洋無脊椎動物