載有hTERT基因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染日本血吸蟲童蟲的研究.pdf

1、迄今為止，應(yīng)用于血吸蟲病防治實踐的技術(shù)仍存在許多不足，尤在控制日本血吸蟲病流行與傳播方面尚無理想方法。30年前有學(xué)者提出，建立穩(wěn)定生長和連續(xù)傳代培養(yǎng)的血吸蟲細(xì)胞系，可為尋求新的防治技術(shù)提供基礎(chǔ)和條件，但通過數(shù)十年的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探索，一直未能實現(xiàn)建立可連續(xù)傳代生長的血吸蟲細(xì)胞系目標(biāo)。本研究受哺乳動物體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源永生化基因后成功建立永生化細(xì)胞系的啟示，開展了采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對日本血吸蟲童蟲細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)理論探索，制備了載

2、有永生化基因(hTERT)的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒和泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并觀察了這2種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因到日本血吸蟲童蟲細(xì)胞或蟲體后所發(fā)生的整合、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以及對Sj細(xì)胞增殖的影響。本研究目的在于為血吸蟲細(xì)胞永生化研究提供理想的轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的載體，驗證外源hTERT基因能否在血吸蟲體內(nèi)整合、表達(dá)及其表達(dá)部位，同時探索hTERT基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的可行性。
　　 目的：探討用雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源基因?qū)肴毡狙x(Sj)細(xì)

3、胞的生物學(xué)理論與實驗依據(jù)。
　　 方法：從GenBank中收集褐家鼠雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒受體(rRam-1)的氨基酸序列，應(yīng)用Blastp工具對其進(jìn)行序列相似性搜索，并用Cluster W2工具對相似性較高的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；采用RPS-blast與InterproScan在線工具對rRam-1受體及其同源的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)域分析；進(jìn)一步應(yīng)用多個在線分析工具對與rRam-1同源的Sj蛋白進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)、疏水性、跨膜性、

4、信號肽、亞細(xì)胞定位以及翻譯后修飾點(diǎn)等進(jìn)行分析與預(yù)測；在生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上采用含短片段外源基因的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Sj-12d童蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，并應(yīng)用PCR與RT—PCR方法檢測外源基因在Sj細(xì)胞中的整合與表達(dá)。
　　 結(jié)果：rRam-1氨基酸殘基序列相似性搜索及同源性分析顯示，其氨基酸序列與多種脊椎動物的鈉離子依賴性的磷酸鹽運(yùn)載體家族的氨基酸序列有很高的同源性，一致性均在59％以上，其中，與中國倉鼠Ram-1受體(cRa

5、m-1)和人類Ram-1(h Ram-1)受體的氨基酸序列一致性均為93％；此外，與多種無脊椎動物磷酸鹽運(yùn)載體家族的氨基酸序列也有較高的同源性，氨基酸一致性在42％以上；Sj中存在2種與rRam-1受體有較高同源性的蛋白SJCHGC09605和SjCHGC05362，它們與rRam-1受體之間的氨基酸序列一致性分別為54％和61％，相似性分別為74％和72％。2種血吸蟲蛋白與人類、褐家鼠及中國倉鼠的Ram-1受體蛋白處于平行的進(jìn)化分枝上

6、。保守性分析顯示，2種Sj蛋白與人類、褐家鼠及中國倉鼠的Ram-1受體存在相同的PH04 Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，均為磷酸鹽運(yùn)載體超家族成員；二級結(jié)構(gòu)顯示，SJCHGC09605和SJCHGC05362蛋白中，α螺旋分別占68.97％和39.22％，跨膜區(qū)預(yù)測顯示分別有7個和5個可能的區(qū)域，與疏水性預(yù)測結(jié)果完全一致；亞細(xì)胞定位及翻譯后修飾位點(diǎn)分析顯示，2種蛋白均不含信號肽序列和亞細(xì)胞定位信號，也不含糖基化、磷酸化和脂酰化等翻譯

7、后修飾位點(diǎn)。利用攜帶外源E77.43基因的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Sj童蟲細(xì)胞后，經(jīng)PCR與RT—PCR檢測到目的基因存在與表達(dá)，擴(kuò)增的目的片段大小為330 bp，與理論值相符。
　　 結(jié)論：雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒rRam-1受體與日本血吸蟲細(xì)胞膜上起離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道或受體蛋白作用的SjCHGC09605和SjCHGC05362兩種跨膜蛋白成分存在較高同源性；用載有E77.43基因的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Sj童蟲細(xì)胞獲得成功，推測SjCHGC0

8、9605和SjCHGC05362兩種與rRam-1受體同源的蛋白可能是Sj感染過程中起作用的分子。該結(jié)果為下一步用雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化基因至Sj細(xì)胞提供了生物學(xué)理論與實驗依據(jù)。
　　 目的：建立含永生化基因(hTERT)的穩(wěn)定產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞株，觀察hTERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)Sj童蟲細(xì)胞后的整合和表達(dá)情況以及對細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 方法：將從美國引進(jìn)的。pBABE—puro—hTERT質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切、PCR

9、擴(kuò)增和測序鑒定確認(rèn)；倍比稀釋測定PA317細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞對嘌呤霉素的最高耐受濃度；用脂質(zhì)體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PA317細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過PCR、測序、免疫熒光、Western-blot及透射電鏡對抗性細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，并以NIH3T3細(xì)胞測定收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒液滴度。常規(guī)制備Sj-12d童蟲細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)中用BrudU—ELISA法檢測細(xì)胞增殖情況，PCR法檢測兔線粒體特異性基因確定無宿主來源細(xì)胞污染

10、，倍比稀釋法測定Sj細(xì)胞對嘌呤霉素的最高耐受濃度；用濃縮的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Sj-12d童蟲細(xì)胞并以嘌呤霉素連續(xù)篩選培養(yǎng)獲得抗性Sj細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后用PCR、RT—PCR、Western-blot檢測外源hTERT基因和puror基因在細(xì)胞內(nèi)的整合與表達(dá)；用3H-TdR摻入法檢測嘌呤霉素抗性Sj一12d細(xì)胞的增殖能力，利用細(xì)胞計數(shù)法繪制其生長曲線，并應(yīng)用TRAP—ELISA法測定其端粒酶活性。
　　 結(jié)果：pBABE—pu

11、ro—hTERT質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定為目的質(zhì)粒；PA317細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞對嘌呤霉素的最高耐受濃度為6μg/ml和3μ g/m1；嘌呤霉素抗性PA317克隆擴(kuò)大培養(yǎng)物經(jīng)PCR、測序、免疫熒光以及Western-blot檢測到外源hTERT基因和puror基因的整合、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)；透射電鏡檢測到抗性PA317細(xì)胞的培養(yǎng)上清及胞漿內(nèi)有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的存在，經(jīng)濃縮后測得其滴度為2×105cfu/ml。Sj-12d童蟲細(xì)胞培養(yǎng)

12、3d后即可見部分細(xì)胞分裂相，10-14d后可見較多分裂相，BrdU—ELISA也顯示培養(yǎng)14d后有明顯的DNA合成與增殖，其對嘌呤霉素最高耐受濃度為0.5μg/ml；雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Sj-12d細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素連續(xù)篩選21d可見抗性克隆形成，對擴(kuò)大培養(yǎng)后的抗性細(xì)胞做PCR、RT—PCR和Western blot，檢測到外源hTERT基因和puror基因在抗性Sj-12d細(xì)胞內(nèi)的整合、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，但整合的拷貝數(shù)少，轉(zhuǎn)錄水平低下；3

13、H-TdR摻入法檢測顯示抗性Sj-12d細(xì)胞與常規(guī)培養(yǎng)的Sj—12d細(xì)胞均有一定增殖能力，但二者間差異無顯著性(P>0.05);TRAP—ELISA實驗未能從抗性Sj—12d細(xì)胞內(nèi)檢測到端粒酶活性；在培養(yǎng)4周內(nèi)的抗性Sj-12d細(xì)胞生長相對較快，此后生長逐漸減慢，死亡細(xì)胞和退變細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多，最后全部死亡。
　　 結(jié)論：用pBABE—puro—hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞后，成功建立含hTERT基因穩(wěn)定產(chǎn)雙嗜性

14、逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的細(xì)胞株；該病毒感染Sj-12d童蟲細(xì)胞后可檢測到外源hTERT基因和puror基因的整合、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，但整合拷貝數(shù)少，轉(zhuǎn)錄水平低下，未能激活Sj-12d細(xì)胞的端粒酶活性和改善細(xì)胞的增殖能力。
　　 目的：為提高逆轉(zhuǎn)錄病毒對血吸蟲的感染能力，探討應(yīng)用pVSV-G質(zhì)粒和pBABE—puro—hTERT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞制備泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒的可行性，并觀察該病毒感染Sj童蟲后外源基因在蟲體內(nèi)的整合、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及具體

15、的表達(dá)部位情況。
　　 方法：將pVSV—G質(zhì)粒和pBABE—puro—hTERT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2—293包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用濃縮的上清液與Polybrene混合液感染NIH3T3細(xì)胞系，經(jīng)嘌呤霉素連續(xù)篩選12d后獲得抗性克隆，計數(shù)抗性克隆數(shù)目并計算病毒滴度；挑取抗性NIH3T3克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以PCR檢測外源hTERT基因和puror基因在細(xì)胞內(nèi)的整合，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測hTERT基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

16、情況；將泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒加入到體外培養(yǎng)的Sj-12d童蟲，感染24h后更換培養(yǎng)基，將蟲體連續(xù)培養(yǎng)6d；采用PCR和Southern雜交檢測外源hTERT基因在蟲體內(nèi)的整合，同時應(yīng)用RT—PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)染色檢測外源力hTERT基因在蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及定位情況。
　　 結(jié)果：經(jīng)計數(shù)后，泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒滴度為3.2×108，抗性NIH3T3細(xì)胞經(jīng)PCR擴(kuò)增出外源hTERT基因和puror基因特異性

17、145bp和204bp目的條帶，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測到hTERT基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了蛋白質(zhì)表達(dá)，表達(dá)部位以細(xì)胞核內(nèi)為主；泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的蟲體經(jīng)PCR和RT—PCR擴(kuò)增出了外源hTERT基因和puror基因特異性145bp和204bp目的產(chǎn)物，其中，hTERT基因的轉(zhuǎn)錄水平較高，而puror基因的轉(zhuǎn)錄水平則較低，Southern雜交也顯示出蟲體內(nèi)有外源hTERT基因的多個拷貝整合；Western blot實驗顯示病毒感染后的蟲體內(nèi)