TRAIL及受體在少突膠質(zhì)細胞發(fā)育中的表達及在誘導(dǎo)OPC凋亡中的作用.pdf

1、早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷是導(dǎo)致早產(chǎn)兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因，嚴重危害早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量，目前尚缺乏有效的防治措施。少突膠質(zhì)細胞的前體細胞(OPC)是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的主要靶細胞，凋亡是OPC死亡的主要形式。死亡受體途徑是OPC的凋亡的主要途徑;該途徑由腫瘤壞死因子超家族介導(dǎo)。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞

2、死因子超家族中的一員，近年來研究發(fā)現(xiàn)TRAIL及其受體在正常細胞廣泛表達，并參與細胞的存活和免疫監(jiān)視，因而備受關(guān)注。該受體在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究主要集中在脫髓鞘疾病，目前尚缺乏TRAIL受體表達調(diào)控對少突膠質(zhì)細胞保護作用的研究，也缺少TRAIL及其受體在發(fā)育中腦白質(zhì)損傷中的作用的研究報道。因此，進一步探索TRAIL及其受體在少突膠質(zhì)細胞發(fā)育中的作用，以及調(diào)控TRAIL受體對少突膠質(zhì)細胞的保護作用，將有助于我們更好的理解早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)病

3、機制，為更有效地防治早產(chǎn)兒腦損傷提供新的思路。
　　第一部分人少突膠質(zhì)系細胞體外擴增培養(yǎng)及分化鑒定
　　應(yīng)用條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)方法對人少突膠質(zhì)前體細胞株(HOPC)進行培養(yǎng)。通過免疫組織化學(xué)方法培養(yǎng)細胞的進行鑒定。人少突膠質(zhì)祖細胞PDGFRα熒光標記陽性，人前少突膠質(zhì)細胞O4熒光標記陽性，人未成熟少突膠質(zhì)細胞O1熒光標記陽性，成熟少突膠質(zhì)細胞MBP熒光標記陽性。通過流式細胞術(shù)對培養(yǎng)細胞的純度進行鑒定，少突膠質(zhì)祖細胞組中PDG

4、FRα(+)/O4(-)細胞的百分比為97.06％;前少突膠質(zhì)細胞組中O4(+)/O1(-)細胞的百分比為96.01％;未成熟少突膠質(zhì)細胞組中O4(+)/O1(+)細胞的百分比為95.3％;成熟少突膠質(zhì)細胞組中MBP(+)細胞的百分比為91.6％。我們選用的HOPCs具有少突膠質(zhì)祖細胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點;通過不同的條件限定培養(yǎng)基，HOPCs可以分化為前少突膠質(zhì)細胞、未成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞;通過此方法可獲得高純度的少突膠質(zhì)祖

5、細胞、前少突膠質(zhì)細胞、未成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞。
　　第二部分 TRAIL及受體在少突膠質(zhì)細胞發(fā)育中的表達及作用
　　既然我們獲得了高純度的少突膠質(zhì)祖細胞、前少突膠質(zhì)細胞、未成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞，通過RT-PCR及Western blot2種方法，分別從mRNA水平和蛋白水平檢測4組處于不同發(fā)育階段中的人少突膠質(zhì)細胞表面TRAIL及其受體的表達情況。在不同發(fā)育階段的4組人少突膠質(zhì)細胞上均未檢測到TR

6、AIL的表達，但是4組細胞的表面均可檢測到TRAIL受體的表達。不同發(fā)育階段的人少突膠質(zhì)細胞表面的TRAIL受體的表達存在差異性。TRAIL-R1和TRAIL-R2在人少突膠質(zhì)祖細胞及前體細胞呈現(xiàn)出高表達性;而TRAIL-R3和TRAIL-R4則主要表達在未成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞的表面。再分別給予不同發(fā)育階段的4組人少突膠質(zhì)系細胞以不同濃度的重組可溶性TRAIL刺激后（2 ng/ml;20 ng/ml;200 ng/ml及2

7、000 ng/ml），通過流式細胞術(shù)(AnnexinV-FITC和PI)觀察細胞的凋亡情況。隨著TRAIL濃度的增加，各組細胞的凋亡率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢;TRAIL對少突膠質(zhì)系細胞的損傷作用呈現(xiàn)明顯的量一效關(guān)系和成熟依賴性。TRAIL主要誘導(dǎo)少突膠質(zhì)祖細胞和前少突膠質(zhì)細胞凋亡。TRAIL誘導(dǎo)少突膠質(zhì)系細胞的凋亡主要發(fā)生在TRAIL刺激后的24-48 h。
　　第三部分下調(diào)DR4/DR5，上調(diào)DcR1/DcR2對OPC的保護作用

8、r>　　我們發(fā)現(xiàn)TRAIL受體在少突膠質(zhì)細胞發(fā)育過程中的表達存在差異，TRAIL誘導(dǎo)少突膠質(zhì)系細胞的凋亡呈現(xiàn)量-效關(guān)系和成熟依賴性。于是我們進一步探索調(diào)控TRAIL受體是否對OPC具有保護作用。采用小分子siRNA干擾下調(diào)少突膠質(zhì)祖細胞上的TRAIL-DR4/DR5的表達;采用pcDNA3.1慢病毒包埋上調(diào)少突膠質(zhì)祖細胞上的TRAIL-DcR1/DcR2的表達。分別給予siRNA-DR4組、siRNA-DR5組、pcDNA3.1-DcR