電離輻射致內(nèi)耳毛細(xì)胞放射性損傷機(jī)制的初步研究以及鼻咽癌放療后內(nèi)耳聽力損傷的臨床分析.pdf

1、研究背景和目的：
　　 目前放療安全性得到了放療工作者的廣泛關(guān)注，2010年3月國(guó)際放療權(quán)威雜志《IntJRadiatOncolBiolPhys》發(fā)表了《正常組織效益臨床定量分析》(QUANTEC)指南，指出了放射治療中內(nèi)耳等16個(gè)不同器官受輻射后存在晚期損傷。鼻咽癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，尤以華南地區(qū)發(fā)病率最高，僅廣東省的年發(fā)病率就高達(dá)30/萬以上。鼻咽癌放療治愈率高，較多患者能夠長(zhǎng)期生存，然而在鼻咽癌放射治療時(shí)，聽覺系統(tǒng)常被

2、包括在高劑量照射野內(nèi)，其中內(nèi)耳的放射性損傷多為晚期不良反應(yīng)，常表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聽力下降(sensorineuralhearingloss，SNHL)，通常在放療結(jié)束后6至12月內(nèi)發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道鼻咽癌放療晚期SNHL發(fā)生率高達(dá)50％以上，而目前對(duì)于SNHL尚無有效治療方法，它不僅阻礙患者社會(huì)交往活動(dòng)，甚至能發(fā)展成為耳聾，對(duì)患者認(rèn)知功能、心理情緒等也造成不良后果，嚴(yán)重影響鼻咽癌患者的生存質(zhì)量。
　　 由于內(nèi)耳體積較小且結(jié)構(gòu)精細(xì)，其放

3、療相關(guān)生理、生化方面研究報(bào)道甚少;耳蝸毛細(xì)胞作為內(nèi)耳感覺神經(jīng)的終末細(xì)胞，是產(chǎn)生正常聽力的基本功能單元，有關(guān)其放射損傷機(jī)制方面的研究更是鮮有報(bào)道。而且有關(guān)內(nèi)耳放療損傷回顧性臨床研究特別是調(diào)強(qiáng)放療治療模式下鼻咽癌放療后內(nèi)耳聽力損傷的臨床分析數(shù)據(jù)并不多。因此，開展一系列內(nèi)耳放射損傷機(jī)制的研究，結(jié)合鼻咽癌放療晚期內(nèi)耳聽力損傷的臨床觀察，是極具中國(guó)特色、地域價(jià)值和意義的。
　　 本研究首先通過射線照射耳毛細(xì)胞株HEI-OC1，并從細(xì)胞增殖

4、、DNA損傷、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面證實(shí)耳毛細(xì)胞發(fā)生放射性損傷，然后采用miRNA芯片分析正常耳毛細(xì)胞與發(fā)生放射損傷的耳毛細(xì)胞株之間miRNA表達(dá)譜差異，篩選差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并初步探討了miR-207在耳毛細(xì)胞放射損傷中的作用;然后，使用丹參酮ⅡA對(duì)耳毛細(xì)胞株的放射損傷模型進(jìn)行干預(yù)，來觀察其對(duì)HEI-OC1放射性損傷的保護(hù)作用，并初步探討可能的保護(hù)機(jī)制;最后從臨床的角度，通過聽力學(xué)檢測(cè)觀察鼻咽癌病人行根治性調(diào)

5、強(qiáng)放療后內(nèi)耳聽力損傷現(xiàn)狀，并結(jié)合病人年齡、性別、疾病分期、內(nèi)耳受照劑量以及是否同步化療等因素進(jìn)行多因素回歸分析，尋找放療晚期SNHL發(fā)生的可能的危險(xiǎn)相關(guān)因素，為臨床上防治放療晚期SNHL的發(fā)生發(fā)展提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、耳毛細(xì)胞株HEI-OC1放射損傷模型的建立及其miRNA表達(dá)譜差異分析。采用不同劑量的高能X線照射，通過MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)志γH2AX、流式細(xì)胞

6、儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡確定耳毛細(xì)胞株發(fā)生放射性損傷。然后通過miRNA芯片檢測(cè)發(fā)生放射性損傷的耳毛細(xì)胞株與正常耳毛細(xì)胞株的miRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)miRNA，并采用QRT-OCR進(jìn)行驗(yàn)證，挑選mir-207做進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)靶基因及靶基因功能分類，然后通過轉(zhuǎn)染方法，過表達(dá)以及抑制mir-207的表達(dá)，觀察其表達(dá)異常對(duì)HEI-OC1細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 2、丹參酮ⅡA對(duì)放射引起的耳毛細(xì)胞株HEI-OC1

7、損傷的保護(hù)作用。首先用不同濃度的丹參酮ⅡA作用于HEI-OC1細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，證明丹參酮ⅡA無耳毒性副作用。然后將細(xì)胞分組為對(duì)照組(0Gy)、照射組(16Gy)以及加藥組(16Gy+TanⅡA)，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX與P65共定位，QRT-PCR以及免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)情況。
　　 3、分別于放療前、放療后1個(gè)月、6個(gè)月以及放療

8、后1年檢測(cè)鼻咽癌病人的純音聽閾、聽性腦干反應(yīng)以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射等聽力學(xué)指標(biāo)，評(píng)價(jià)鼻咽癌病人放療后的聽力狀況，然后通過對(duì)包括性別、年齡、TNM分期、內(nèi)耳照射劑量以及是否同步化療在內(nèi)的5個(gè)因素進(jìn)行回歸分析，以探討鼻咽癌放療晚期SNHL發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)射線照射后，MTT檢測(cè)結(jié)果

9、顯示耳毛細(xì)胞株HEI-OC1的增殖能力隨射線照射劑量的增高而減弱;γH2AX的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增高，HEI-OC1細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂程度加重，并且劑量越高，其DNA損傷修復(fù)減緩，甚至不能完全修復(fù);細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果則提示射線照射后細(xì)胞周期分布會(huì)出現(xiàn)G2期細(xì)胞比例隨照射劑量增加而增多的趨勢(shì)，且細(xì)胞凋亡百分比也隨著照射劑量的增加而增加。
　　 2、通過miRNA表達(dá)譜分析，篩選出在照射后表達(dá)下調(diào)的miRNA有9個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有

10、3個(gè)。QRT-PCR對(duì)其中部分miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示mmu-miR-101a*，mmu-miR-375*,mmu-miR-491*,mmu-miR-92a-1*，mmu-miR-207，mmu-miR-466i-5p的表達(dá)與芯片結(jié)果基本一致。選取表達(dá)差異倍數(shù)最大的mmu-miR-207進(jìn)行進(jìn)一步的分析，通過靶基因預(yù)測(cè)以及Go分類分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因主要涉及細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白激酶的調(diào)控、細(xì)胞增殖的調(diào)控、DNA損傷的應(yīng)

11、答機(jī)制以及神經(jīng)發(fā)育等多種生物過程。用mir-207的mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染HEI-OC1細(xì)胞，并通過QRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，然后用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變，結(jié)果顯示過表達(dá)mir-207使耳毛細(xì)胞的放射性損傷程度加重，而抑制其表達(dá)未能改變耳毛細(xì)胞的放射損傷程度。
　　 3、通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了加入丹參酮ⅡA可以減弱射線照射對(duì)HEI-OC1細(xì)胞增殖能力的損傷以，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以減少射線誘導(dǎo)

12、的細(xì)胞凋亡，而免疫熒光共定位結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA能阻止放射誘導(dǎo)的耳毛細(xì)胞株中的P65/NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)位過程，并通過QRT-PCR和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白AKT和P21在丹參酮ⅡA干預(yù)下，其表達(dá)與單純放射組相比有差異，因此丹參酮ⅡA可能通過抑制射線誘導(dǎo)的AKT的表達(dá)下調(diào)以及P21的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞對(duì)射線抵抗力增強(qiáng)。
　　 4、臨床研究顯示:通過檢測(cè)鼻咽癌病人放療前后純音聽閾，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌放療后聽力損傷中，高頻區(qū)聽力損傷

13、較低頻區(qū)出現(xiàn)早（放療后1個(gè)月高頻聽閾平均提高了15.00dB，而低頻區(qū)平均升高1.69dB），且損傷程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加重（放療后1年，高頻聽閾平均提高20.65dB，低頻區(qū)為17.91dB）。放療后1年SNHL的發(fā)生率為57.45％(54/94)。聽性腦干反應(yīng)的檢查結(jié)果提示鼻咽癌患者放療后聽神經(jīng)通路無明顯損傷。而反映耳蝸外毛細(xì)胞功能的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢查顯示放療后發(fā)生SNHL患者的DPOAE幅值較放療前明顯下降，說明外毛

14、細(xì)胞發(fā)生了放射性損傷進(jìn)而影響了耳蝸聽力放大的正常功能。經(jīng)多因素回歸分析，結(jié)果提示病人就診時(shí)年齡偏大、TNM分期以及聯(lián)合同步順鉑化療是放療后SNHL發(fā)生的危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論：
　　 1、X線照射可以抑制耳毛細(xì)胞株HEI-OC1增殖，造成細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯以及細(xì)胞凋亡;
　　 2、照射后HEI-OC1細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，其中miR-207的過表達(dá)加重了HEI-OC1細(xì)胞的放