重組雞α干擾素-白細(xì)胞介素-2融合蛋白體外活性及體內(nèi)最佳使用劑量研究.pdf

1、為了研究重組雞α干擾素/白細(xì)胞介素-2融合蛋白（rChIFN-α-Linker-ChIL-2，重組融合蛋白）在雞體外的生物學(xué)活性及在雞體內(nèi)的最佳使用劑量，從而為重組融合蛋白作為抗病毒制劑和免疫增強(qiáng)劑在臨床上推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，本研究采用夾心ELISA方法分別檢測重組融合蛋白與抗rChIFN-α和rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的活性；采用50％細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行了重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照在CEF細(xì)胞上抗水泡性口炎病毒

2、（VSV）和傳染性法氏囊病病毒（IBDV）LX強(qiáng)毒株的活性比較研究；采用MTS法進(jìn)行了重組融合蛋白和rChIFN-α在體外促外周血T淋巴細(xì)胞（PBLC）和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)。將IBDV LX強(qiáng)毒株人工感染37日齡SPF雞，同時分別選取在CEF細(xì)胞上抗VSV活性單位為200IU、1000IU、3000IU、5000IU的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白采用注射方式進(jìn)行雞體內(nèi)活性比較實(shí)驗(yàn)，以篩選重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白在雞

3、體內(nèi)發(fā)揮最佳抗病毒和免疫增強(qiáng)活性的使用劑量；分別通過臨床觀察、檢測攻毒前和攻毒后（dpc）不同時間雞體的排毒率、IBDV在不同組織器官的動態(tài)分布、外周血帶毒時間、外周血中ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α、ChIFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)水平，雞PBLC和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性及外周血中淋巴細(xì)胞亞群等指標(biāo)的差異以揭示重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白在雞體內(nèi)抗病毒和免疫增強(qiáng)作用的機(jī)理，并且篩選重組融合蛋白和rChIFN

4、-α蛋白在雞體內(nèi)發(fā)揮最佳抗病毒活性的最適劑量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測14d的SPF雞注射以上實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白后不同時間對雞外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量的影響。
　　結(jié)果：重組融合蛋白可分別與抗rChIFN-α和抗rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，重組融合蛋白中rChIFN-α蛋白和rChIL-2蛋白的相對含量分別為4.58×103pg.mL-1和1.06×103pg.mL-1；重組融合蛋白在CE

5、F細(xì)胞上抗VSV和IBDV的活性單位分別為8.707×105IU/mL和5.7926×104IU/mL，rChIFN-α蛋白對照的活性單位分別為2.1469×105IU/mL和1.4482×104IU/mL，兩種蛋白抗VSV活性單位均高于抗IBDV，且重組融合蛋白的抗病毒活性高于rChIFN-α蛋白；重組融合蛋白具有顯著的促PBLC和雞脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性，且重組融合蛋白極顯著高于rChIFN-α蛋白對照（p<0.01）。不同劑量的重

6、組融合蛋白在雞體的抗病毒活性存在差異。注射后不同時間，3000IU重組融合蛋白試驗(yàn)組的IBD典型癥狀持續(xù)時間、病死率、排毒率、各組織器官帶毒率、外周血持續(xù)帶毒率（28h、20％、22.2%、16.7%、23.5%）、血清中抗IBDV抗體水平等指標(biāo)均顯著低于其他劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照，ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α、ChIFN-γ五種細(xì)胞因子的表達(dá)水平均顯著高于其他組；12 dpc時，不同實(shí)

7、驗(yàn)組雞的外周血T淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性達(dá)到峰值，且3000IU重組融合蛋白實(shí)驗(yàn)組雞的OD490值（0.2654、0.3406）均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組雞（p<0.05）；12 dpc～35 dpc期間，不同劑量的攻毒實(shí)驗(yàn)組雞的CD4+/CD8+比值均顯著低于相同劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照組，其中3000IU的重組融合蛋白攻毒組雞的CD4+/CD8+比值顯著高于其他劑量的攻毒實(shí)驗(yàn)組雞和所有rChIFN-α蛋白對照攻毒

8、實(shí)驗(yàn)組；以上各項(xiàng)檢測指標(biāo)表明，重組融合蛋白的體內(nèi)、外抗病毒和免疫增強(qiáng)活性均高于rChIFN-α蛋白對照，且3000IU的重組融合蛋白在雞體內(nèi)具有最佳的抗病毒和免疫增強(qiáng)活性。重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白應(yīng)用SPF雞體后（3 dpi），外周血中CD3+CD4+細(xì)胞的含量升高，CD3+CD8+細(xì)胞的含量降低，CD4+/CD8+比值大幅升高，且重組融合蛋白實(shí)驗(yàn)組CD4+/CD8+比值顯著高于rChIFN-α蛋白實(shí)驗(yàn)組。
　　結(jié)論：重

9、組融合蛋白可與抗rChIFN-α和抗rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；在體外具有顯著的抗VSV和IBDV活性和促外周血T淋巴細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性。不同劑量的重組融合蛋白在雞體內(nèi)可通過增強(qiáng)外周血T淋巴細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性、提高機(jī)體IFN-α和Th1、Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平、提高CD4+/CD8+比值等方式增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平，發(fā)揮非特異性抗病毒活性和免疫增強(qiáng)活性；3000IU的重組融合蛋白在雞體內(nèi)具有最