內(nèi)含不同類(lèi)型RNA的重組MS2噬菌體病毒樣顆粒的表達(dá)及其應(yīng)用研究.pdf

1、H7N9禽流感病毒是一種新亞型流感病毒，于2013年3月在我國(guó)上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。H7N9禽流感病毒感染后的死亡率較高，因此對(duì)該病毒早期準(zhǔn)確的診斷成為挽救患者生命的關(guān)鍵。
　　作為一種RNA病毒，H7N9禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病毒核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增等多個(gè)步驟，每一步操作不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，誤導(dǎo)臨床診斷，延誤患者的治療。為了提高全國(guó)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室H7N9禽流感病毒的檢測(cè)能力，2013年

2、7月衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織了一次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。我們制備了基于MS2噬菌體病毒樣顆粒(Bacteriophage MS2 virus-likeparticles，MS2 VLPs)的內(nèi)含H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein，MP)和核蛋白(Nucleoprotein，NP)四種蛋白全長(zhǎng)RNA序列的質(zhì)控品，向全國(guó)參與H7N9病毒檢

3、測(cè)的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放，以評(píng)價(jià)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室H7N9禽流感病毒的檢測(cè)能力，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室提高檢測(cè)水平。所發(fā)放的樣本盤(pán)含有10個(gè)樣本，其中包括6個(gè)含不同濃度H7N9禽流感病毒基因的陽(yáng)性樣本和4個(gè)H7N9陰性樣本（包括1個(gè)MP基因陽(yáng)性的樣本）。樣本盤(pán)發(fā)放到全國(guó)79家進(jìn)行H7N9禽流感病毒分子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室H7和N9兩個(gè)基因的檢測(cè)情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析。我們共收到80份回報(bào)結(jié)果（其中一家實(shí)驗(yàn)室回報(bào)了2份結(jié)果），其中77份結(jié)果

4、采用real-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè):60份采用商品化試劑盒檢測(cè)，17份采用實(shí)驗(yàn)室自配試劑檢測(cè);還有3份結(jié)果采用等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示82.5％的實(shí)驗(yàn)室能夠正確檢測(cè)不同濃度的H7N9禽流感病毒樣本及陰性樣本。但是仍有17.5％的實(shí)驗(yàn)室需要改進(jìn)檢測(cè)能力，有待改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室中大部分漏檢了相對(duì)較低濃度的N9基因?？傮w檢測(cè)的假陰性率為5.6％，假陽(yáng)性率為0.6％，選用不同的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法得山的結(jié)果不盡相同。本次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

5、的結(jié)果表明我國(guó)大多數(shù)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具備了H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)的能力。
　　MS2 VLPs不僅能夠包裝外源mRNA，還可以用于miRNAs前體的包裝，用來(lái)作為miRNAs的遞送載體。在第二部分中，我們通過(guò)對(duì)MS2 VLPs表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造，制備了表面展示細(xì)胞穿透肽HIV-1 TAT且內(nèi)含miR-122前體的重組MS2VLPs—TAT-MS2-miR122 VLPs，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TAT-MS2-miR122 VLPs能夠

6、攜帶miR-122前體進(jìn)入Hep3B肝癌細(xì)胞系，在細(xì)胞內(nèi)加工成成熟的miR-122，使Hep3B細(xì)胞內(nèi)miR-122表達(dá)水平升高，高表達(dá)的miR-122通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)靶蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。這一部分中我們將兩條重復(fù)的MS2噬菌體衣殼蛋白編碼序列串聯(lián)組成單鏈二聚體，并在單鏈二聚體序列的N端插入帶有連接臂的穿透肽HIV-1 TAT的cDNA序列，隨后把這一嵌合序列構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒pESC-URA的Gal10啟動(dòng)子下游;將與

7、包裝位點(diǎn)序列串聯(lián)的pre-miR-122序列構(gòu)建到Gal1啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建完成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細(xì)胞中，搖菌表達(dá)得到TAT-MS2-miR122 VLPs。結(jié)果顯示采用不同劑量的TAT-MS2-miR122 VLPs處理三種不同類(lèi)型的細(xì)胞，均檢測(cè)到miR-122表達(dá)水平不同程度的升高，可持續(xù)穩(wěn)定約120小時(shí)。TAT-MS2-miR122 VLPs處理Hep3B細(xì)胞后，伴隨著miR-122水平的升高，Western Blot檢測(cè)到

8、miR-122的兩個(gè)靶蛋白胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor1 receptor, IGF1R)和去整合素樣金屬蛋白酶10(Adisintegrin and metalloproteinase10，ADAM10)表達(dá)水平下降。IGF1R和ADAM10均在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，兩種蛋白表達(dá)下降將影響Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了TAT-MS2-miR122