Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽對(duì)內(nèi)含反義RNA病毒樣顆粒和siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)及對(duì)HCV抑制作用的研究.pdf

1、目的： 通過Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)含反義RNA的MS2 VLPs和siRNA，為MS2 VLPs作為藥物載體進(jìn)行探討，以及為siRNA的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)提供新方法。 方法： 將編碼MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白的序列插入pET28(b)載體，構(gòu)建包裝載體pET-MS2，并將該載體與pACYC-HIV質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.Coli BL21(DE3)，篩選陽性菌落，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16hr，超聲波碎菌，形成MS2 V

2、LPs。經(jīng)過CsCl密度梯度離心純化后用于交聯(lián)。 通過化學(xué)合成的方法獲得Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，在交聯(lián)劑Sulfo-SMPB作用下，等摩爾比的Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與MS2 VLPs交聯(lián)，形成Tat-MS2 VLPs交聯(lián)物。與Hela細(xì)胞孵育6 hr，通過FITC直接標(biāo)記VLPs或間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 從人HCV陽性血清中提取HCV RNA，RT-PCR擴(kuò)增獲得HCV 5’UTR和IRES序列，反向插入

3、pACYCDuet-1表達(dá)載體，形成pACYC-HCV質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建正向插入載體的陰性對(duì)照。pACYC-HCV質(zhì)粒與pET-MS2包裝載體同時(shí)轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.Coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16 hr，超聲波碎菌，形成內(nèi)含反義RNA的MS2VLPs。經(jīng)過CsCl密度梯度離心純化，RT-PCR鑒定VLPs，然后與等摩爾比的Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽交聯(lián)，交聯(lián)物與含HCV-螢光素酶報(bào)告基因的Huh-7細(xì)胞孵育，24 hr后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

4、螢光素酶活性。 利用Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運(yùn)針對(duì)HCV Con 1b 5’UTR區(qū)的siRNA。在交聯(lián)劑Sulfo-SMPB作用下，等摩爾比的Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與siRNA交聯(lián)，形成Tat-siRNA交聯(lián)物。分別取含0.5μg、1.0μg和1.5μg的交聯(lián)物與含HCV復(fù)制子的Huh-7細(xì)胞孵育24 hr，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取結(jié)果，檢測(cè)螢光素酶活性，用實(shí)時(shí)(real-time)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中HCV RNA

5、的濃度。同時(shí)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染1.0μg的siRNA，作為對(duì)照。 結(jié)果： 利用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，MS2衣殼蛋白成功的包裝了外源RNA，形成了MS2VLPs，與Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽化學(xué)交聯(lián)后轉(zhuǎn)入了Hela細(xì)胞，用FITC直接標(biāo)記VLPs或間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下均可以觀察到發(fā)黃綠色熒光的細(xì)胞。 將內(nèi)含反義RNA的MS2 VLPs與Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過交聯(lián)劑Sulfo-SMPB交聯(lián)后

6、，在轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的作用下VLPs轉(zhuǎn)入了含HCV-螢光素酶報(bào)告基因的Huh-7細(xì)胞。并且在細(xì)胞內(nèi)反義RNA下調(diào)了螢光素酶的表達(dá)。 Tat47-54轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和HCV 5’UTR區(qū)siRNA的交聯(lián)物與含HCV復(fù)制子的Huh-7細(xì)胞孵育24-48 hr后，在熒光顯微鏡下可以觀察到發(fā)紅色熒光的細(xì)胞。裂解細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶活性及對(duì)HCV RNA濃度定量檢測(cè)結(jié)果說明，與對(duì)照相比較，不同劑量的交聯(lián)物均可抑制螢光素酶活性，并且隨劑量的增加抑制作用也相應(yīng)增

7、強(qiáng)。 結(jié)論： 采用化學(xué)交聯(lián)法將HIV-1 Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和MS2 VLPs交聯(lián)，為轉(zhuǎn)運(yùn)MS2 VLPs進(jìn)入細(xì)胞提供了新方法。 利用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)形成的內(nèi)含針對(duì)HCV 5’UTR和IRES區(qū)反義RNA的MS2VLPs，在Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽作用下成功的轉(zhuǎn)入了Huh-7細(xì)胞，而且包裝的反義RNA下調(diào)了靶基因的表達(dá)。通過該研究，為反義RNA和MS2 VLPs的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了新方法。 通過化學(xué)交聯(lián)形成Tat