HCV NS3解旋酶RNA對HCV自身翻譯具有抑制作用.pdf

1、丙型肝炎病毒是丙型肝炎的病原體，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化，部分可發(fā)展成肝癌。目前較為認(rèn)可的治療方案是干擾素聯(lián)合利巴韋林，但它的副作用較大，花費(fèi)較高，持續(xù)應(yīng)答率較低。因此，尋找更為有效的抗HCV治療方法迫在眉睫。由于HCV在體內(nèi)復(fù)制水平低，難以建立一個令人滿意的高效體外復(fù)制、感染模型。因此，對HCV生活周期以及其內(nèi)部基因表達(dá)調(diào)控的研究顯得非常重要。本課題在研究HCV NS3解旋酶對HCV IRES的翻譯啟動活性的影響，并試圖探討HCV翻譯自

2、身調(diào)控的機(jī)制。
　　方法:(1)構(gòu)建HCV NS3全長和HCV NS3解旋酶表達(dá)質(zhì)粒;構(gòu)建HCV NS3解旋酶的突變型及其表達(dá)缺陷質(zhì)粒;(2)以HCVIRES調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)的質(zhì)粒pCMVNCRLuc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞模型作為研究體系，利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后檢測熒光素酶表達(dá)活性;(3)提取細(xì)胞RNA，RT-PCR檢測pCMVNCRLuc、細(xì)胞IFN-β和PKR的mRNA的相對表達(dá)。
　　結(jié)

3、果:(1)質(zhì)粒酶切鑒定和測序結(jié)果證明正確構(gòu)建了HCVNS3解旋酶及其突變型和表達(dá)缺陷質(zhì)粒;(2)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，HCVNS3解旋酶及其突變型表達(dá)質(zhì)粒均可抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)，HCV NS3解旋酶表達(dá)缺陷質(zhì)粒同樣可抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性;(3) RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中質(zhì)粒pCMVNCRLuc和轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK mRNA的相對表達(dá)水平無顯著性差異;細(xì)胞中未檢測出IFN-β表達(dá)，PKR mRNA的相對表達(dá)水平無顯著性