HIV的噬菌體核酸疫苗的制備及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒是引起艾滋病的病原體，分為兩型，HIV-1和HIV-2，HIV-1在全球范圍傳播廣泛，是艾滋病流行的主要病原體。目前，人類免疫缺陷病毒感染的流行尚處于早期階段，在未來的二十年內(nèi)，全世界HIV感染率會明顯升高。 近年來對亞單位疫苗、多肽疫苗、減毒活疫苗、滅活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、重組病毒載體疫苗及核酸疫苗等多種不同的HIV候選疫苗進(jìn)行了大量的研究。人們對核酸疫苗寄予厚望，其最大的優(yōu)點(diǎn)是疫苗抗原在靶細(xì)胞內(nèi)以天然的方式

2、合成、加工并呈遞給免疫系統(tǒng)，可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答包括Th應(yīng)答和CTL應(yīng)答，并且其保護(hù)性免疫應(yīng)答對不同亞型的病毒具有交叉抵御作用。近年來，HIV核酸疫苗主要針對HIV外膜蛋白基因，這種疫苗可以誘導(dǎo)出較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。當(dāng)前，HIV核酸疫苗主要針對較為保守的HIV核心結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白基因。這些蛋白核苷酸序列在不同的HIV-1毒株中變異性較小，而這些蛋白在HIV的生命周期和HIV感染致病性中起著重要作用。

3、 常用的核酸疫苗的載體有質(zhì)粒、腺病毒和牛痘病毒等。最近噬菌體介導(dǎo)的DNA疫苗的出現(xiàn)，恰恰克服了這些核酸疫苗的缺陷，噬菌體不但具有生產(chǎn)工藝簡單、制備快速容易、自然條件下儲存比較穩(wěn)定(4C穩(wěn)定保存至少6個月)、在宿主的真核組織中不能復(fù)制、避免了抗生素?cái)y帶和可通過口服途徑呈遞抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠容納較大的外源片段(長達(dá)23Kb)和多個疫苗基因，因此這類疫苗將成為以后幾年內(nèi)研究的熱點(diǎn)。 為了開發(fā)HIV-1流行毒株的噬菌體核酸疫苗，

4、本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三個方面的研究，分別如下： 1.HIV-1B亞型候選基因(gp120、gp41、gag)及綠色熒光蛋白基因(gfp)在原核細(xì)胞中的表達(dá)及其多克隆抗體的制備。 以HIV-1B亞型U26942全基因DNA質(zhì)粒及重組質(zhì)粒pUC18/gfp為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出gp120、gp41、gag及gfp基因，再將這些基因與pMD18-T連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和DNA序列分析鑒定后，用相應(yīng)的酶對基因重組正確的克隆

5、進(jìn)行酶切，將所得目的基因插入到質(zhì)粒pET28b(+)相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)/gp120、pET28b(+)/gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp，進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列分析。用基因重組鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。利用Ni-NTAagarose對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，用所獲得的重組融合蛋白及其純化產(chǎn)物免疫家兔

6、，制備兔抗HIVgp120、gag及gfp多克隆抗血清。結(jié)果示：對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見在1.44Kb、1.04Kb、1.5Kb、0.7Kb處有明顯的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的gp120、gp41、gag及gfp基因長度相符；對重組克隆質(zhì)粒pMD18-T/gp120、pMD18-T/gp41、pMD18-T/gag及pMD18-T/gfp進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在1.44Kb、1.04Kb、1.5Kb、0.7Kb

7、處發(fā)現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)期連接的基因片段相符，DNA序列分析結(jié)果與相應(yīng)的基因序列一致，表明目的基因已被正確克隆,質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)/gpl20、pET28b(+)/gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，與空白對照相比較在分子量55.4kDa(gp120)、57.5kDa(gag)和29.9kDa(gfp

8、)發(fā)現(xiàn)明顯蛋白帶，而gp41沒有表達(dá)，Westernblot證實(shí)重組蛋白可以與抗組氨酸單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；目的蛋白經(jīng)Ni-NTAagarose進(jìn)行純化，用所獲得的重組融合蛋白及其純化產(chǎn)物免疫家兔，制備了兔抗HIVgp120、gag及gfp多克隆抗血清。 2.HIV-1B亞型候選基因(gp120、gp41、gag)及綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 克隆人類免疫缺陷病毒Ⅰ型B亞型包膜糖蛋白gp

9、120、gp41基因和核心蛋白gag基因以及綠色熒光蛋白基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步為制各自行設(shè)計(jì)的以λ噬菌體作為載體的HIV核酸疫苗及其陽性對照奠定基礎(chǔ)。以克隆好的HIV-1B亞型U26942全基因質(zhì)粒DNA及pUC18/gfp作為模板，根據(jù)Genbank中g(shù)p120、gp41基因和核心蛋白gag基因的核苷酸序列及綠色熒光蛋白的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并在引物的5’端分別引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位點(diǎn)，特異性的擴(kuò)增

10、包膜糖蛋白gp120、gp41基因和核心蛋白gag基因以及綠色熒光蛋白基因。TA克隆后經(jīng)雙酶切、測序等鑒定重組質(zhì)粒，再經(jīng)雙酶切、連接構(gòu)建含包膜糖蛋白gp120、gp41和核心蛋白gag以及綠色熒光蛋白編碼基因的真核表達(dá)載體，并進(jìn)行酶切鑒定分析pcDNA3.1(+)/gp120、pcDNA3.1(+)/gp41、pcDNA3.1(+)/gag及pcDNA3.1(+)/gfp。 3.HIV噬菌體疫苗的制備及其免疫學(xué)特性研究。

11、 構(gòu)建好的含有HIV核心蛋白gag基因的噬菌體在大腸桿菌Y1088中進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行純化、濃縮，即過夜感染的培養(yǎng)物先用DNA酶和RNA酶進(jìn)行處理，加入氯化鈉，離心去掉細(xì)胞碎片，噬菌體顆粒再用聚乙烯已二醇沉淀，然后離心，重懸沉淀，加入氯仿提取液，液相進(jìn)行超速離心，從而得到較純的含有HIV核心蛋白gag基因的噬菌體，用噬菌體緩沖液多次洗滌后可以儲存于4C備用。8-10周齡C57小鼠，體重20g左右，隨機(jī)分成兩組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組：肌肉注射

12、含gag基因的噬菌體疫苗100μl/只(2μg)；對照組：肌肉注射噬菌體緩沖液100μl/只。在14天、28天時(shí)同樣劑量加強(qiáng)免疫，42天時(shí)取血，用Westernblot法檢測特異性抗HIV-1gag抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gag的位置上有特異性的目的條帶，說明含有g(shù)ag基因的重組噬菌體免疫小鼠可以誘導(dǎo)特異性的體液免疫應(yīng)答，初步驗(yàn)證了用噬菌體作為核酸疫苗載體的可行性。因此，噬菌體核酸疫苗價(jià)格便宜，制備工藝簡單，高效，并且能夠容納較大的外源片段(長達(dá)

13、23Kb)和多個疫苗基因，這種全新簡易的核酸疫苗制備策略將會越來越廣泛的得到推廣應(yīng)用。 總之，本研究成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)/gp120、pET28b(+)gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp；pET28b(+)/gp120、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp可高效表達(dá)目的蛋白；純化后的目的蛋白制備了多克隆抗體。另外，還構(gòu)建了HIV-1B亞型候選基因(gp120、g