中藥肺瘤平膏對樹突狀細胞免疫調(diào)控的研究.pdf

1、本研究以樹突狀細胞為切入點,實驗研究對肺瘤平膏按藥物組成的功能功效進行拆方,從微觀角度比較了不同功效中藥對DC的遷移、DC刺激T細胞增殖以及DC-LPAK細胞殺傷腫瘤細胞能力的影響,揭示不同中藥在調(diào)節(jié)免疫中的作用,進一步闡明肺瘤平膏的作用機制。臨床研究從宏觀出發(fā),首先對肺癌患者DC亞群的變化進行研究,并初步探討了DC亞群與中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性,同時對肺瘤平膏治療晚期肺癌的近期及遠期療效進行研究,并比較治療前后DC亞群的變化,初步探討肺瘤

2、平膏的療效與DC亞群變化的關(guān)系。
　　 一.肺瘤平膏及其拆方對DC趨化功能的影響
　　 采用transwell小室檢測DC在趨化因子白細胞介素8(IL-8)和RANTES作用下趨化指數(shù)(CI)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同中藥對DC的趨化能力有不同的影響。IL-8的作用下,益氣組中藥DC趨化性最強(CI=1.112),活血組(CI=1.084)、肺瘤平組(CI=1.027)次之,而解毒組DC趨化性最低(CI=0.874),益氣組與

3、空白血清組比較,P<0.05,益氣組、活血組與解毒組比較,.P<0.05。在RANTES的作用下,肺瘤平組DC趨化性最強(CI=1.185),依次為活血組(CI=1.075)、益氣組(CI=1.048),解毒組DC趨化性最低(CI=0.917),肺瘤平組與空白血清組、解毒組比較,P<0.05。說明肺瘤平膏、益氣藥、活血藥對DC的遷移有不同促進作用,而解毒藥物則抑制DC的遷移,不同類中藥對DC的遷移影響不同,在不同的趨化因子的作用下,DC

4、的遷移功能也不相同。
　　 二.肺瘤平膏及其拆方作用下DC表面CCR7、CXCR4的改變
　　 通過realtime-PCR的方法,對DC表面趨化因子受體CCR7、CXCR4的表達進行了分析,以闡明不同治則中藥對DC趨化影響的分子機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同類中藥作用下,DC表面趨化因子受體CCR7、CXCR4的表達不同。益氣組CCR7表達最高,活血組、肺瘤平組次之,解毒組最低,其中,益氣組、活血組與解毒組比較,P<0.05。而

5、CXCR4,益氣組、肺瘤平組表達最高,活血組次之,解毒組最低,肺瘤平組、益氣組、解毒組與空白血清組比較,P<0.01,解毒組與其他各組比較,P<0.01。提示不同中藥作用下DC趨化能力的改變可能與趨化因子受體的表達有關(guān)。
　　 三.肺瘤平膏及其拆方調(diào)節(jié)免疫突觸及刺激T細胞增殖作用的動態(tài)成像研究
　　 采用雙光子激光共聚焦顯微鏡活細胞動態(tài)成像及流式細胞儀檢測技術(shù),觀察DC與T細胞混合培養(yǎng)后,免疫突觸(IS)形成及T細胞增殖

6、的動態(tài)過程,進一步探討肺瘤平膏及拆方調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫作用機制及不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定的時限內(nèi),T細胞的增殖與IS形成呈一定正相關(guān)；肺瘤平膏、益氣方均可促進IS的形成,延長其結(jié)合時間；肺瘤平膏無論DC:T的混合比如何,在調(diào)節(jié)IS形成、刺激T細胞增殖效應方面,明顯優(yōu)于其拆方各組,.P<0.05或0.01,而且,隨時相的延長,其效應更加明顯；解毒藥則在調(diào)節(jié)IS形成及調(diào)節(jié)T細胞增殖方面,和其他各組相比較,均不同程度顯示出一定的抑制趨勢,P<0.05

7、或0.01。說明IS的形成在DC刺激T細胞增殖中發(fā)揮重要作用,肺瘤平膏及其益氣組分能促進IS形成,刺激T細胞增殖。
　　 四.肺瘤平膏及其拆方對DC刺激LPAK抗腫瘤活性的影響
　　 比較肺瘤平膏及各拆方中藥對DC影響LPAK細胞殺傷腫瘤細胞活性的不同,探討不同治則方藥對DC-LAPK的作用,以期為指導臨床用藥提供初步的實驗依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),LPAK:Tumor(L:T)為10:1或5:1組時,各中藥組DC誘導的LPAK細

8、胞,殺傷活性明顯高于對照組,P<0.05。L:T為10:1時,肺瘤平、益氣組、活血組與解毒組及各對照組比較,P<0.05。L:T為5:1時,各中藥組與對照組比較,P<0.05,肺瘤平、益氣中藥、活血中藥對DC誘導LPAK細胞殺傷腫瘤細胞的能力的影響對解毒中藥高。組內(nèi)比較,即L:T(10:1)與L:T(5:1)比較,解毒組、空白DC對照組、T+LPAK組,P<0.05,余各組比較,P>0.05。肺瘤平組、益氣組、活血組在L:T為5:1與1

9、0:1時,誘導LPAK的殺傷活性基本相同,與LPAK細胞的比例關(guān)系不大。可見肺瘤平膏、活血藥、益氣藥可不同程度增強DC-LPAK殺傷腫瘤細胞的作用,而解毒藥則對其有抑制作用。
　　 五.肺瘤平膏及拆方對肺癌Lewis小鼠脾T細胞增殖能力及CTL的影響
　　 通過比較不同中藥對.Lewis肺癌小鼠脾淋巴細胞增殖能力及CTL的影響,以闡明肺瘤平膏的免疫機制。結(jié)果顯示荷瘤各組脾T淋巴細胞增殖能力均較正常組降低,具有顯著性差異(

10、P<0.01),與模型對照組比較,正常對照組和肺瘤平組脾T細胞增殖指數(shù)均明顯增高,有顯著統(tǒng)計學差異,P<0.00；各組與肺瘤平組比較,同樣有統(tǒng)計學差異,P<0.01、0.05。CD8+CD28+(CTL)比例各組間比較無統(tǒng)計學差異,P=0.092,從高到低依次:肺瘤平組、正常對照組,益氣組、活血組、CTX組、解毒組、模型對照組。與模型組比較,正常對照組、肺瘤平組P<0.05；與正常對照組比較,CTX組、解毒組、模型對照組.P<0.05；

11、另外,肺瘤平組與CTX組、解毒組比較,P<0.05。結(jié)果表明肺瘤平膏較其他拆方各組更能刺激脾T淋巴細胞的增殖,并可增加了CTL在淋巴細胞中的比例,可以推測這是肺瘤平膏抗腫瘤的免疫機制之一。
　　 六.非小細胞肺癌患者外周血DC亞群測定及意義
　　 選用99例非小細胞肺癌(NSCLC)患者,并以23例健康人做對照,觀察NSCLC患者外周血中DC亞群的變化,探討其與臨床特征的關(guān)系,并采用ROC曲線進行特異性和靈敏性檢驗。結(jié)果

12、發(fā)現(xiàn)患者外周血樹突狀細胞DC1(CDllc+)的比例與對照組比較顯著降低(P=0.009),DC2(CD123+)的比例與對照組比較無明顯變化(P=0.655),DC1/DC2較對照組低(P=0.177)；DC1、DC1/DC2與患者分期之間比較有顯著性差異(.P=0.032、0.001),DC1在患者KPS之間比較也有明顯差異(P=0.023),KPS<60患者低于KPS≥60者。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血DC1、DC1/DC2

13、比率曲線下面積分別為0.671,0.702(P=0.011、0.003)。DC1/DC2與生存時間有關(guān),生存時間大于1年患者與小于1年患者比較,P=0.028,二分類Logistic分析和Cox分析發(fā)現(xiàn)DC1/DC2與肺癌患者的生存時間有關(guān),為肺癌患者生存的獨立預后因素(P=0.034、0.024)之一,DC1/DC2高者生存時間長。表明對NSCLC患者進行外周血DC亞群監(jiān)測,有助于全面了解其免疫狀態(tài),判斷預后。
　　 七.非小

14、細胞肺癌患者外周血DC亞群與辨證分型的相關(guān)性研究
　　 選擇99例NSCLC住院患者,探討DC亞群與中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)肺癌的辨證分型和患者的性別、年齡、分期、病理類型、KPS以及CEA的正常與否無明顯相關(guān)性。DC1和DC2在各證型之間基本差異不大,DC1由高到低依次為氣虛痰濕證、陰虛熱毒證、氣虛瘀滯證、氣陰兩虛證,DC2依次為氣虛痰濕證、氣陰兩虛證、陰虛熱毒證、氣血瘀滯證。DC1/DC2比值的變化在各證型之間有顯著差

15、異,P=0.012,氣虛痰濕證比值最高,氣陰兩虛證比值最低。初步說明DC1/DC2與肺癌中醫(yī)辨證分型有一定相關(guān)性。
　　 八.肺瘤平膏改善非小細胞肺癌患者免疫狀態(tài)及預后的臨床研究
　　 采用隨機單盲平行對照的臨床研究方法,將符合納入標準的60例非小細胞肺癌患者隨機分為治療組和對照組,治療組給予肺瘤平聯(lián)合化療,對照組單純化療,觀察近期療效、免疫功能及生存時間的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):瘤體療效,治療組CR0例,PR9例,SD14例,

16、PD6例,有效率33.33％,對照組CR0例,PR7例,SD13例,PD10例,有效率26.67％,兩組比較P>0.05。治療組患者DC1、DC1/DC2、NK細胞與對照組比較治療后較前增高(P<0.05、0.01、0.05)。生存分析發(fā)現(xiàn)治療組1年生存率43％,對照組1年生存率28％,兩組的總生存時間比較(χ2=1.764,P=0.184)。說明肺瘤平膏在提高晚期肺癌患者的1年生存率,改善生活質(zhì)量,延長生存期同時可以明顯升高DC1比例

17、和DC1/DC2比值,改善機體免疫功能。
　　 九.DC亞群變化與判斷肺癌臨床療效及預后的初步探討
　　 通過觀察肺癌患者治療后T淋巴細胞亞群及DC亞群與生存期的關(guān)系,比較其在評估臨床療效方面的價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+升高者1年生存率38％,降低者生存率36％,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.100,P=0.752)。DC1/DC2升高者1年生存率50％,降低者生存率24％(χ2=6.769,P=0.009)。以DC