RFRP-3在幼齡綿羊組織中的表達(dá)及其參與繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、RF酰胺相關(guān)肽-3(RFamide-related peptide-3，RFRP-3)是促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的同系物，它對(duì)動(dòng)物的生殖、攝食、應(yīng)激及行為有調(diào)節(jié)作用。RFRP-3/GnIH在許多物種中的基因序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)分布以及生物學(xué)功能的研究先后被報(bào)道。由于RFRP-3具有調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖和攝食的雙重作用，科學(xué)家們推測(cè)RFRP-3可能參與動(dòng)物的繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)

2、控。目前，對(duì)于RFRP-3在綿羊組織中的表達(dá)以及其是否參與繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以3月齡雌性綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在研究RFRP-3基因在幼齡綿羊各組織中的特異性表達(dá)及RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢組織中表達(dá)定位的基礎(chǔ)上，采用限飼的方法首先研究限飼是否影響幼齡綿羊卵巢的發(fā)育，然后研究RFRP-3以及GnRHR、FSHR、LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸的表達(dá)。通過(guò)以上研究探討RFRP-3在幼齡綿羊生殖發(fā)育過(guò)程中的作用，以及其參與

3、繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的機(jī)制。
　　1.RFEP-3基因在幼齡綿羊各組織中的表達(dá)情況
　　應(yīng)用普通PCR和熒光定量PCR檢測(cè)RFRP-3基因在幼齡綿羊各組織中表達(dá)情況，結(jié)果表明RFRP-3基因在延髓中表達(dá)量最高，其次在眼、卵巢、脊髓、子宮和下丘腦等組織中表達(dá)量較高，在心、肝、脾、肺和腎等組織中表達(dá)量相對(duì)較低。這個(gè)結(jié)果揭示了RFRP-3在幼齡綿羊各個(gè)組織中具有廣泛的分布，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中表達(dá)量相對(duì)較高，而在內(nèi)臟及消化系統(tǒng)中表

4、達(dá)量較低，這可能與RFRP-3的生物學(xué)功能有關(guān)。
　　2.RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢組織中的表達(dá)定位
　　應(yīng)用免疫組化的方法研究RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢的各級(jí)卵泡中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，RFRP-3在各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中都有表達(dá)。在原始卵泡和初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RFRP-3的表達(dá)。而RFRP-3在次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中不表達(dá)或微弱表達(dá)，在三級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中有較強(qiáng)表達(dá)。RFRP-3在卵

5、巢間質(zhì)和卵巢膜中有微弱的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果暗示RFRP-3在幼齡綿羊卵巢組織中有特異性分布，可能對(duì)卵泡發(fā)育及卵巢功能有調(diào)節(jié)作用。
　　3.限飼對(duì)幼齡綿羊卵巢發(fā)育的影響
　　研究高水平限飼（50％自由采食量）和低水平限飼（70％自由采食量）對(duì)幼齡綿羊卵巢發(fā)育的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)47天的不同水平飼喂，高水平限飼和低水平限飼極顯著降低了幼齡綿羊的卵巢體積、卵巢重和體重。高水平的限飼顯著降低了“卵巢重/體重”的比值。對(duì)卵巢組織采用石蠟

6、切片及HE染色后分析結(jié)果表明，限飼對(duì)幼齡綿羊的原始卵泡和初級(jí)卵泡的數(shù)目影響不顯著。然而，高限飼組極顯著降低了次級(jí)卵泡和三級(jí)卵泡的數(shù)目。限飼對(duì)卵泡閉鎖率的影響不顯著，但是高限飼組顯著降低幼齡綿羊的卵泡募集率。這個(gè)結(jié)果證明限飼對(duì)幼齡綿羊的卵巢發(fā)育有抑制作用。
　　4.限飼對(duì)幼齡綿羊RFRP-3、 GnRHR、FSHR和LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸表達(dá)的影響
　　通過(guò)熒光定量PCR研究高水平限飼（50％自由采食量）和低水平限飼

7、（70％自由采食量）對(duì)幼齡綿羊下丘腦-垂體-卵巢組織中RFRP-3、GnRHR、FSHR和LHR基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明:限飼顯著提高RFRP-3在下丘腦-垂體-卵巢軸中的表達(dá)。相反，限飼顯著抑制了GnRHR、FSHR和LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸中的表達(dá)。結(jié)果暗示限飼導(dǎo)致RFRP-3的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)RFRP-3抑制下丘腦-垂體-卵巢軸從而抑制卵巢的發(fā)育，進(jìn)一步驗(yàn)證了RFRP-3參與繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控。
　　以上試驗(yàn)結(jié)果證明，RFR