LRRN3的組織表達(dá)及其對(duì)小腦出生后發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的研究是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要內(nèi)容，發(fā)育機(jī)制的闡明將為許多老年性疾病、發(fā)育畸形以及神經(jīng)損傷后修復(fù)等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的防治帶來曙光。發(fā)育過程受到許多因素的調(diào)控，基因調(diào)控是其中的重要部分，基因及其表達(dá)產(chǎn)物可通過不同信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育和分化。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)富亮氨酸重復(fù)3(Neuronal L,eucine Rich Repeat3，LRRN3)是神經(jīng)系統(tǒng)富亮氨酸重復(fù)超家族的成員，蛋白結(jié)構(gòu)中包含LRR結(jié)

2、構(gòu)域、IgC2樣結(jié)構(gòu)域以及FNⅢ樣結(jié)構(gòu)域這些與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的結(jié)構(gòu)域。研究表明LRRN3 mRNA在不同發(fā)育階段的胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中存在，提示LRRN3可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起作用，但具體作用和機(jī)制目前仍不清楚。深入研究LRRN3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)和功能，將有助于我們進(jìn)一步了解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，并為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)疾病的防治提供基礎(chǔ)理論支持。
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分借助基因工程技術(shù)制備了兔抗大鼠LRRN3多克隆抗體。運(yùn)

3、用生物信息學(xué)方法分析LRRN3蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇C端一段抗原性強(qiáng)、表面暴露性好的肽段，根據(jù)原核表達(dá)載體Mal—pET21a(+)-His閱讀框架設(shè)計(jì)引物；以從大鼠腦組織反轉(zhuǎn)錄出的總cDNA為模板擴(kuò)增出目標(biāo)片段，與載體連接后在大腸桿菌JM109中擴(kuò)增；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中表達(dá)出重組的Mal-LRRN3C-His融合蛋白。以此純化的蛋白為抗原免疫新西蘭兔，制備并純化了兔抗大鼠LRRN3多克隆抗體。經(jīng)ELISA、Wester

4、n Blot和免疫組化檢測(cè)，該抗體具有較高的效價(jià)和特異性。
　　 實(shí)驗(yàn)第二部分采用兩種方式對(duì)LRRN3蛋白的組織表達(dá)譜尤其是其在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)進(jìn)行了研究。利用現(xiàn)有的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫資源，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，借助基于EST策略的電子雜交方法和基于GEO(Gene Expression Omnibus，基因表達(dá)大棚車)數(shù)據(jù)的分析方法對(duì)LRRN3的組織表達(dá)譜進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示大鼠LRRN3 mRNA主要存在于變態(tài)階段的胚胎及幼年

5、和成年動(dòng)物中，表達(dá)部位主要在腦、脊神經(jīng)根、心、肝和腎等組織。借助免疫組化和Western Blot等實(shí)驗(yàn)手段，研究LRRN3蛋白在大鼠體內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果顯示，LRRN3蛋白主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮質(zhì)多極神經(jīng)元、海馬齒狀回顆粒層細(xì)胞以及小腦蒲肯野細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中無陽性表達(dá)，其它組織沒有明顯陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LRRN3蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)存在密切關(guān)系。
　　 為進(jìn)一步了解LRRN3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，我們重點(diǎn)研究了LR

6、RN3蛋白對(duì)大鼠小腦出生后發(fā)育的影響。腹腔注射LRRN3多克隆抗體中和新生大鼠體內(nèi)的內(nèi)源性LRRN3蛋白，借助行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、電鏡技術(shù)和免疫組化等實(shí)驗(yàn)手段觀察抗體注射后大鼠小腦形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的改變，從而探討LRRN3蛋白對(duì)小腦生后發(fā)育的影響及可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物小腦中LRRN3陽性染色的蒲肯野細(xì)胞數(shù)和陽性強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物平衡能力較對(duì)照組差，相同時(shí)間點(diǎn)的兩組動(dòng)物靜態(tài)平衡時(shí)間(Balance latency,BL)差

7、異具有顯著性(P<0.05)；透射電鏡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組部分蒲肯野細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞固縮，細(xì)胞周圍和分子層存在水腫，分子層中突觸終末數(shù)量明顯少于對(duì)照組；囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Vesicular glutamate transporter1，VGluT1)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠出生后P7、P14和P21天小腦中均有表達(dá)，從P7、P14到P21天，VGluT1陽性分子層隨發(fā)育進(jìn)行而不斷增厚，相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物VGluT1陽性分子層厚度在P7