let--7 miRNA表達水平及抑制活性的研究.pdf

1、L e t ．7m i R N A 表達水平及抑制活性的研究壩L 研究生：劉雪榮導(dǎo) 帆呂建新教授吳小兵教授浙江省溫州醫(yī)學(xué)院檢驗生命學(xué)院浙江省遺傳學(xué)重點實驗室浙江溫州，3 2 5 0 3 5答辯委員會委員答辯委員會主席：蘞腿與答辯委員會委員：諺元擊同囪氧王岳俑主發(fā)j答辯日期：2 0 1 2 年5 月J 孑臼∞?膩學(xué)航碩i 學(xué)位* 女L e t 一7m i R N A 表達水平及抑制活性的研究碩士研究生劉雪榮導(dǎo) 師：呂建新教授吳小兵教授浙江

2、省溫卅f 醫(yī)學(xué)院檢驗生命學(xué)院浙江省遺傳學(xué)重點實驗室浙江溫州．3 2 5 0 3 5m i R N A 是生物體內(nèi)源性的長度為1 8 ～2 5 n t ( n u c l e o t i d e ) 非編碼R N A 。在生物體內(nèi)，m i R N A 與A r g o 等相關(guān)蛋白形成R N A 沉默復(fù)合物( R I S C ．R N A I n d u c e dS i l e n c i n g C o m p l e x ) ，識別并

3、結(jié)合到m R N A 的3 ’u r R 靶序列．使其翻譯抑制或降解，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)m R N A 的表達。在人類．大約三分之一的蛋白的表達是通過這種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)方式來調(diào)節(jié)的。在干細胞分化，分裂、凋亡和生物發(fā)育、衰老、死亡、刖，瘤、感染過程。} I 發(fā)揮著重要的作J H 。成熟m i R N A 的5 1 端2 ～8 n t范圍的堿基被稱為S e e d 區(qū)，m i R N A 存在相同的S e e d 區(qū)的歸為同一個家族( f a

4、 m i l y ) ，例如，m i R N A 3 0 家族、I e t ．7 家族。L e t - 7 m i R N A 家族是生物體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的m i R N A 家族之，其結(jié)構(gòu)及功能芷不同種屬司高度保守。在人糞，I e I _ 7 m i R N Am 1 1 個基因甚編碼8 個家族成員。L e t 一7m i R N A 在干細胞分化、細胞周期調(diào)節(jié)、神經(jīng)肌肉發(fā)育、細胞增殖、控制發(fā)育的時序性、癌癥及感染等病理生理過程中發(fā)揮重要

5、的作用。本研究是對I e I ．7 m i R N A 表達水平及抑制活性的研究。首先，眥p A A V 2 n e o - G l u c - ( F l u c ) 為基本骨架．構(gòu)建并獲得檢測l e t ．7 家旗m I R N A 抑制活性的8 種質(zhì)粒型載體，并包裝為相應(yīng)的重組腺相關(guān)病毒( R e c o m b i n a n ta d e n o ．a(chǎn) s s o c i a t e dv i r u s 。r A A V )

6、 ．作為檢測m i R N A 靶序列介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后抑制活性的傳感器，命名為A s e n s o r 。在此基礎(chǔ)上，檢測H e k a S 3 細胞及B H K 2 I 細胞l d 一7m i R N A 的抑制活性．并檢測l e t - 7m i R N A 的表達水平，研宄了不同細胞中l(wèi) e l 一7m i R N A 表達水平及抑制活性水平不一致。然后，以p A A V 2 m i r _ C M V - R F P 為基本骨架．

7、該結(jié)構(gòu)的特點是在C M V 啟動子后面有一個內(nèi)含子m v i n ( m v m ．i n , o n ) ，諺內(nèi)舍子含有M l u l 、N o t l 、X b a I 等酶切位點，用于m i R N A 表達部分的插入，分別構(gòu)建井獲得了p A A V 2 n e o ．C M V - 7 a l - R F P 、p A A V 2 n e o - C M V - 7 a 2 - R F P 、p A A V 2 n e o -

8、C M V - 7 a 3 一R F P 、p A A V 2 n e o - C M V - 7 b —R F P 、p A A V 2 n e o - C M V - 7 c ．R F P 、p A A V 2 n c o - C M V - 7 d - R F P 、p A A V 2 n e o - C M V - T c —R F P 、p A A V 2 n c o * C M V - 7 f l - R F P 、p A