CD147及整合素拮抗劑抑制RA患者Th17細(xì)胞分化的作用和意義.pdf

1、【背景】
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)以關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為特征,是一種常見(jiàn)的慢性、系統(tǒng)性炎性機(jī)能紊亂的自身免疫性疾病,其病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明確。Thl7細(xì)胞作為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的輔助性T細(xì)胞(Th),在RA發(fā)病中過(guò)度表達(dá)IL-17并通過(guò)上調(diào)多種促炎因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),于RA病程的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的作用。
　　因此,Th17細(xì)胞的

2、分化及調(diào)控機(jī)制成為人們研究熱點(diǎn)。現(xiàn)今有關(guān)Th17細(xì)胞分化的研究主要集中于多種細(xì)胞因子作用下的體外培養(yǎng),而體內(nèi)是一個(gè)相互交錯(cuò)的免疫網(wǎng)絡(luò),多種細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞均參與Th17細(xì)胞的分化與調(diào)控。RA滑膜中浸潤(rùn)著大量的來(lái)自骨髓的單核細(xì)胞,這些細(xì)胞遷移至關(guān)節(jié)后活化分化為滑膜巨噬細(xì)胞。在遷移至關(guān)節(jié)滑膜的過(guò)程中,單核細(xì)胞吞噬外源性抗原。在關(guān)節(jié)中,單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的巨噬細(xì)胞可以將吞噬消化的抗原遞呈給記憶性T細(xì)胞,并引發(fā)T細(xì)胞的活化與分化。近期PNAS有文獻(xiàn)

3、報(bào)道RA患者體內(nèi)活化的單核細(xì)胞特異性誘導(dǎo)Th17細(xì)胞應(yīng)答,且不依賴(lài)TNF-及IL-1等細(xì)胞因子作用,而是以細(xì)胞接觸的方式促進(jìn)Th17細(xì)胞反應(yīng)。CD147作為一種跨膜分子,可能參與T細(xì)胞免疫突觸形成與T細(xì)胞活化:CD147在TCR/CD3活化的T細(xì)胞表達(dá)上調(diào),且共定位于TCR/CD3介導(dǎo)的帽形結(jié)構(gòu)或免疫突觸中;采用CD147單克隆抗體5A12可下調(diào)IL-2及其受體CD25的表達(dá)。CD147分子有諸多配體,其中包括CyPA: X線衍射及核磁

4、共振顯示CD147與CyPA相互結(jié)合位點(diǎn)與肽脯氨酸異構(gòu)酶(Peptidelprolyl cistransisomersae,PPIase)活性活性位點(diǎn)相重疊。CyPA又為免疫抑制劑CsA作用蛋白受體,有文獻(xiàn)報(bào)道CsA有抑制免疫突觸形成的作用。同時(shí),CD147是一個(gè)潛在的粘附分子,可與整合素家族3β1、6β1、4β1等形成復(fù)合物,參與細(xì)胞粘附等多種生物學(xué)作用。CD147與RA關(guān)系密切:RA患者滑膜中CD147分子和mRNA表達(dá)均顯著增高,

5、活動(dòng)期RA患者的關(guān)節(jié)組織中CD147的染色范圍更為廣泛,并且同浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞相關(guān)。為研究在RA發(fā)病機(jī)制中,Th17細(xì)胞和CD147分子可能參與的重要作用,本實(shí)驗(yàn)擬建立體外CD14~+和CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系,從而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞;并在RA和健康人對(duì)照中,針對(duì)可能與免疫突觸相關(guān)的CD147分子和其配體(整合素與CyPA),通過(guò)阻斷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD147分子和整合素是否參與單核細(xì)胞誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的過(guò)程。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:【目的】<

6、br>　　1.摸索活化的CD14~+細(xì)胞誘導(dǎo)CD4~+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的最佳條件,建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。
　　2.驗(yàn)證活化的單核細(xì)胞同CD4~+T細(xì)胞直接接觸作用對(duì)Th17細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。
　　3.觀察比較RA患者與健康人的外周血CD4~+T細(xì)胞和CD14~+單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中Th17細(xì)胞比例,分泌的IL-17含量及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　4.探討CD147抗體、 CsA和整合素拮抗

7、劑cRGD對(duì)RA患者CD4~+T細(xì)胞和CD14~+單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中Th17細(xì)胞生成、表面分子表達(dá)及分化相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β和IL-6分泌的影響。
　　【方法】
　　1.采用免疫磁珠法分離純化健康人外周血CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞,分別在單加CD3mAb、LPS、CD3mAb聯(lián)合LPS,或CD3mAb聯(lián)合不同濃度LPS刺激的不同條件下進(jìn)行共培養(yǎng)(設(shè)不加刺激空白對(duì)照組)。以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子CD4和胞

8、內(nèi)細(xì)胞因子IL-17及IFN-γ,確定各種刺激條件下,誘導(dǎo)生成的Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞等亞群占CD4~+T細(xì)胞的百分比。
　　2.將分離純化的健康人外周血CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞,分別進(jìn)行CD4~+T單獨(dú)培養(yǎng),CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞直接接觸或非直接接觸共培養(yǎng),采用方法1確定的最佳條件刺激分化,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Th17細(xì)胞生成比例。
　　3.收集確診RA的活動(dòng)期患者及健康人外周血,分別采用免疫磁珠

9、法分離純化CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞,以1:1比例共培養(yǎng),采用方法1確定的最佳條件刺激分化,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Th17細(xì)胞。為探索CD147和整合素在促進(jìn)Th17細(xì)胞分化中的作用,在上述刺激和共培養(yǎng)條件下設(shè)立4種拮抗劑——5A12、HAb18、CsA、cRGD的阻斷實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞比例及其表面標(biāo)志CCR4、CCR6和IL-23R表達(dá),ELISA測(cè)定上清中IL-1β、IL-6和IL-17含量。
　　【結(jié)果】<

10、br>　　1.單獨(dú)采用LPS或CD3mAb刺激,分別僅能誘導(dǎo)(1.30±0.19)％、(1.10±0.21)％CD4~+T細(xì)胞表達(dá)IL-17, LPS聯(lián)合CD3mAb刺激顯著增加Th17細(xì)胞比例達(dá)(2.01±0.46)％(P﹤0.05)。在抗CD3mAb刺激條件下,設(shè)LPS濃度0.1μg/mL,1μg/mL,10μg/mL,隨LPS濃度增加,Th17細(xì)胞比例顯著減少(P﹤0.05)。LPS體外刺激3天可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞生成的比例至(2.

11、13±0.32)％,隨時(shí)間推移,Th17細(xì)胞減少(P﹤0.05),而Th1細(xì)胞在6天達(dá)最高比例(17.45±3.04)％。提示低劑量LPS聯(lián)合抗CD3mAb活化的單核細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)CD4~+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。
　　2.在實(shí)驗(yàn)1確定的適宜刺激條件下,CD4~+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及非直接接觸共培養(yǎng)分別可見(jiàn)Th17細(xì)胞比例為(0.61±0.08)％和(1.04±0.36)％,較空白對(duì)照,差異無(wú)統(tǒng)學(xué)意義(P=0.24)。直接接觸

12、共培養(yǎng),刺激后Th17細(xì)胞比例顯著增高可達(dá)(2.39±0.13)％(P＜0.01)。提示共培養(yǎng)體系中CD4~+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化依賴(lài)與活化的單核細(xì)胞直接接觸。
　　3. RA患者外周血的CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中較健康人Th17細(xì)胞比例,培養(yǎng)上清IL-17水平,表達(dá)表面分子IL-23R、CCR4、CCR6的CD4~+T細(xì)胞的比例,及Th17細(xì)胞分化相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-6含量,均顯著升高;

13、 CD147抗體、CsA阻斷實(shí)驗(yàn)減少Th17細(xì)胞、IL-17、IL-1β、IL-6生成,下調(diào)表達(dá)IL-23R的CD4~+T細(xì)胞的比例,cRGD阻斷實(shí)驗(yàn)減少I(mǎi)L-17分泌,下調(diào)表達(dá)IL-23R的CD4~+T細(xì)胞的比例,提示CD147和整合素可能參與CD4~+T與CD14~+單核細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　【結(jié)論】
　　1.建立了體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的單核細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
　　2.證實(shí)了以小室隔離

14、CD4~+T細(xì)胞與CD14~+單核細(xì)胞直接接觸降低Th17細(xì)胞分化比例,提示與活化的單核細(xì)胞間的直接接觸作用對(duì)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化具有重要意義。
　　3.證實(shí)了活動(dòng)期RA患者外周血的CD4~+T與CD14~+單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中Th17細(xì)胞及IL-17水平均顯著高于健康對(duì)照,提示RA可能與Th17細(xì)胞升高相關(guān)。
　　4.發(fā)現(xiàn)了免疫抑制劑CsA對(duì)Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程具有顯著抑制作用,可能為CsA臨床治療機(jī)制提供理論基礎(chǔ)與