TNF拮抗劑治療對(duì)RA患者外周血Th亞群的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是以滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞為特征的全身性慢性自身免疫病，以炎性細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜處浸潤，滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及骨的持續(xù)破壞為特征，研究表明T細(xì)胞尤其是輔助性T細(xì)胞（Thelpercell,Th）在RA的發(fā)病及進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用。在過去的幾十年里，RA被認(rèn)為是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病。Th1的細(xì)胞表型與炎癥有關(guān)，而與之相對(duì)的Th2細(xì)胞在某種程

2、度上可以抗炎癥。Th1/Th2失衡可產(chǎn)生過量的（腫瘤壞死因子）TNF-α，TNF-α誘發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致炎癥的遷延以及關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。
　　近年來，兩群新的Th細(xì)胞亞群——Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，打破了以往僅以Th1/Th2失衡模式解釋RA的發(fā)病及進(jìn)展，深入探討Th亞群細(xì)胞及其相互關(guān)系將有助于運(yùn)用促炎/抗炎細(xì)胞平衡概念全新的了解包括RA在內(nèi)的自身免疫病的發(fā)病機(jī)制，并為這些自身免疫病的治療開拓了新的領(lǐng)域。
　　近10年

3、余來靶向免疫炎性細(xì)胞或分子的生物制劑的應(yīng)用，開啟了RA治療新紀(jì)元。依那西普（etanercept）、英夫利西單抗（infliximab）及阿達(dá)木單抗等抗TNF-α藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)多數(shù)中、重度活動(dòng)性RA具有明顯改善病情和改善預(yù)后的效果。但令人關(guān)注的是，尚有一部分患者不能達(dá)到理想的治療效果。
　　鑒于Th細(xì)胞亞群失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和“瀑布效應(yīng)”的異常是RA發(fā)病及病情進(jìn)展的重要機(jī)制，作為T細(xì)胞分化和應(yīng)答上游和下游調(diào)控的TN

4、F-α的消長必然在此機(jī)制中發(fā)揮重要作用。那么RA患者Th細(xì)胞亞群失衡的嚴(yán)重程度是否會(huì)影響TNF-α拮抗劑的治療效果，使用TNF-α拮抗劑治療后其體內(nèi)Th細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子是否能夠重新分布從而達(dá)到失衡逆轉(zhuǎn)及免疫穩(wěn)態(tài)的維持，這一改變與疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后是否存在聯(lián)系，如果存在聯(lián)系，是否可以通過對(duì)患者免疫狀態(tài)的評(píng)估來預(yù)測患者的治療反應(yīng)和預(yù)后，對(duì)RA患者Th細(xì)胞亞群的深入研究是否能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，這些都是需要密切關(guān)注的問題。
　　因此，本研

5、究旨在建立穩(wěn)定的Th亞群細(xì)胞檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上：1.進(jìn)一步證明RA發(fā)病過程中體內(nèi)存在的Th細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子之間失衡狀態(tài)并觀察患者在接受抗TNF-α藥物治療后體內(nèi)失衡狀態(tài)的改善及與疾病緩解程度的相關(guān)性；2.研究疾病不同病程階段及不同活動(dòng)度時(shí)體內(nèi)Th細(xì)胞亞群及其相關(guān)因子的分布狀況，尤其研究Th17細(xì)胞在不同病期和不同疾病活動(dòng)度時(shí)炎癥表型和趨化因子表達(dá)的情況；3.研究對(duì)抗TNF-α治療效果不同的患者其體內(nèi)治療前后體內(nèi)T細(xì)胞亞群分布及炎癥

6、表型的表達(dá)情況，探討抗TNF-α治療效果不佳或復(fù)發(fā)的可能機(jī)制，為臨床用藥提供參考。
　　方法：（分三部分）
　　1．依那西普對(duì)RA患者外周血Th1/Th2,Th17/Treg及相關(guān)因子的影響
　　選取門診或住院治療的診斷明確的活動(dòng)期RA患者20例，隨機(jī)分為2個(gè)研究組：聯(lián)合治療組，每組10例，給予MTX7.5～15mg口服，每周一次，同時(shí)給予皮下注射ETA每次25mg，每周2次；MTX單藥治療組，單用MTX7.5～15m

7、g治療，口服，每周一次。兩組療程均為12周。另外選取10名年齡、性別與研究病例匹配的健康體檢者作為健康對(duì)照；用疾病活動(dòng)度評(píng)分（DAS28）評(píng)估患者治療前后病情活動(dòng)情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血中Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）占CD4+T細(xì)胞的百分比，比較治療前后Th1/Th2、Th17/Treg平衡在治療前后的變化及其與疾病改善程度的相關(guān)性；用ELISA檢測患者外周血血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ、TN

8、F-α、IL-6、IL-17,、IL-23及抗炎細(xì)胞因子TGF-β、IL-4、IL-10的表達(dá)在治療前后的消長及其與Th細(xì)胞平衡變化的相關(guān)性。
　　2．對(duì)不同病期及不同活動(dòng)程度RA患者外周血中Th細(xì)胞亞群表型和轉(zhuǎn)錄因子的研究
　　選取門診或住院治療的診斷明確的早期RA（病程＜1年)患者41例，既往RA（病程≥1年）患者50例，上述患者根據(jù)疾病活動(dòng)程度又分為低活動(dòng)度（DAS28≤2.6）和中到重度活動(dòng)度（DAS28≥3.2）兩

9、組；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)及胞外染色方法檢測所有RA患者胞內(nèi)因子IFN-γ、IL-17、RORc、Foxp3的表達(dá)及Th17細(xì)胞上CCR6、CCR4、IL-23R的表達(dá)；使用real-timeRT-PCR法測定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表達(dá)量。
　　3．研究TNF-α拮抗劑治療對(duì)RA患者外周血中Th細(xì)胞亞群表型和轉(zhuǎn)錄因子的影響
　　對(duì)2008年12月至2009年12月期間門診或住院的診斷明確的接受TNF-

10、α拮抗劑治療的所有同意簽署知情同意書的RA患者進(jìn)行為期12個(gè)月的隨訪和觀察，從中選取了15例治療12個(gè)月（不伴隨其他DMARDs）后達(dá)到ACR50緩解標(biāo)準(zhǔn)的患者，選取10例治療后（不伴隨其他DMARDs）未達(dá)到ACR20緩解標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)研究。所選的兩組患者在年齡、性別、病程上沒有顯著差異，且所有患者在使用TNF-α拮抗劑治療前疾病嚴(yán)重活動(dòng)（DAS28＞5.1）。所有患者每個(gè)月隨訪一次，進(jìn)行病情評(píng)估和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測；利用流式細(xì)胞

11、術(shù)檢測患者治療前后外周血中Th1、Th2、Th17和Treg占CD4+T細(xì)胞的百分比，檢測胞內(nèi)因子IFN-γ、IL-4、IL-17、RORc的表達(dá)及Th17細(xì)胞上CCR6,CCR4,IL-23R的表達(dá)；使用real-timeRT-PCR法測定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.開始治療前，兩組患者外周血中的Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例均顯著比正常人高（分別p＜0.

12、05，p＜0.001），但Treg細(xì)胞的百分比顯著低于正常人（p＜0.005），而Th2細(xì)胞在三組之間沒有顯著差異。經(jīng)12周治療后，ETA+MTX聯(lián)合治療的患者Th1和Th17占CD4+T細(xì)胞百分比顯著下降（分別p＜0.05，p=0.007），Treg細(xì)胞百分比顯著升高（p=0.033），而對(duì)單獨(dú)MTX治療的患者，各個(gè)細(xì)胞均無明顯差異。Th2細(xì)胞在兩組患者中均沒有明顯變化。
　　所有RA患者治療12周后，其Th17與Treg的比值

13、都顯著下調(diào)，提示RA患者體內(nèi)Th17與Treg之間的平衡有所逆轉(zhuǎn)，而Th1和Th2之間的失衡卻沒有明顯變化。
　　將治療前后DAS28的變化(ΔDAS28)作為疾病改善程度的指標(biāo)，采用Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)使用MTX單獨(dú)治療的患者，其疾病改善程度(ΔDAS28)與Th1/Th2平衡和Th17/Treg平衡的逆轉(zhuǎn)都沒有相關(guān)性，在MTX+ETA聯(lián)合治療的患者，雖然其疾病的改善同Th1/Th2平衡的逆轉(zhuǎn)沒有明顯的相關(guān)性，但與T

14、h17/Treg平衡的逆轉(zhuǎn)有很強(qiáng)的相關(guān)性。
　　接受ETA+MTX聯(lián)合治療的患者，其血清中前炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23的表達(dá)量均較治療前有顯著下降，而抑炎因子TGF-β的表達(dá)顯著上升。在MTX單獨(dú)治療組，并未發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子的表達(dá)有顯著變化。ETA+MTX聯(lián)合治療的患者，其外周血中Th17/Treg平衡同血清中IL-6的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系而與TGF-β的水平呈正相關(guān)關(guān)系。
　　2．早期

15、患者不管病情活動(dòng)與否，體內(nèi)都有較高水平的IL-17+Th17細(xì)胞（p＜0.05)，而既往患者體內(nèi)卻有較高表達(dá)水平的IFN-γ+Th1細(xì)胞（p＜0.05)。早期患者體內(nèi)CCR4+CCR6+T細(xì)胞和CCR4+CCR6-T細(xì)胞都較中晚期患者高（p＜0.05)，且CCR4和CCR6在CD4+T細(xì)胞上的雙陽性表達(dá)同體內(nèi)分泌IL-17的Th17細(xì)胞百分率密切相關(guān)（r=0.972，p＜0.001)，而只表達(dá)CCR4可能與IFN-γ的分泌有關(guān)（r=0.

16、625,p＜0.05)，只表達(dá)CCR6的細(xì)胞可能既可以分泌IFN-γ，也可分泌IL-17（r=0.619,p＜0.05)。
　　疾病活動(dòng)時(shí)Th17上CCR6的表達(dá)比低活動(dòng)度患者顯著升高（p＜0.05)，且早期活動(dòng)患者Th17細(xì)胞上表達(dá)的CCR6比中晚期活動(dòng)患者顯著升高（p＜0.05)。CCR4在Th17細(xì)胞上的表達(dá)在各組RA患者之間沒有顯著差異。對(duì)RORc的表達(dá)，早期RA低活動(dòng)度患者顯著高于中晚期低活動(dòng)度患者（p＜0.05)，但顯

17、著低于早期疾病中重度活動(dòng)的患者（p＜0.05)，中晚期患者疾病活動(dòng)時(shí)表達(dá)顯著高于低活動(dòng)度時(shí)（p＜0.05)。早期RA患者疾病中重度活動(dòng)時(shí)Th17細(xì)胞上表達(dá)的IL-23R顯著高于低活動(dòng)度時(shí)，而對(duì)中晚期患者沒有顯著差異，不論患者疾病是否活動(dòng)，IL-23R在Th17細(xì)胞上的表達(dá)在早期患者都更顯著（p＜0.001)。
　　早期RA患者疾病中重度活動(dòng)時(shí)，F(xiàn)oxp3占CD4+CD25highTreg的百分率顯著低于活動(dòng)度低時(shí)（p＜0.05)，

18、并且不論疾病活動(dòng)與否，中晚期患者外周血中Foxp3表達(dá)率均顯著低于早期患者（p＜0.05)。
　　轉(zhuǎn)錄因子T-betmRNA在各組患者中分子水平的表達(dá)并沒有顯著差異。RORc及Foxp3mRNA的表達(dá)在早期患者沒有顯著差異，但在中晚期患者，疾病活動(dòng)與不活動(dòng)患者的表達(dá)存在差異，表現(xiàn)為RORcmRNA在中重度活動(dòng)患者表達(dá)顯著升高（p＜0.05)，而Foxp3mRNA表達(dá)顯著下降（p＜0.05)。
　　3．經(jīng)TNF-α拮抗劑治療后

19、，Th1占CD4+T細(xì)胞百分比均沒有明顯減少，而Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比顯著降低，且在達(dá)到ACR50反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的患者中降低更明顯，Treg細(xì)胞在達(dá)到ACR50反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的患者中顯著升高，而對(duì)于治療反應(yīng)差（未達(dá)到ACR20緩解）的患者，Treg細(xì)胞并沒有顯著升高。
　　達(dá)到ACR50標(biāo)準(zhǔn)的患者，其外周血中IFN-γ+IL-17-T細(xì)胞及IFN-γ-IL-17+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率均較治療前有明顯下降，而未達(dá)到ACR2

20、0標(biāo)準(zhǔn)的患者，其外周血中的IFN-γ+IL-17+T的百分率相比治療前有所升高且有統(tǒng)計(jì)意義，IFN-γ+IL-17-T細(xì)胞也升高但無統(tǒng)計(jì)意義。
　　達(dá)到ACR50標(biāo)準(zhǔn)的患者，其CCR4、CCR6及IL-23R的表達(dá)均比治療前有顯著下降，且其中CCR4+CCR6+T細(xì)胞和CCR4-CCR6+T細(xì)胞數(shù)量顯著下降，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子RORc的表達(dá)率也顯著下降，而對(duì)未達(dá)ACR20標(biāo)準(zhǔn)的患者，上述細(xì)胞炎癥表型的表達(dá)均無顯著變化。
　　達(dá)到A