miR-125b通過調(diào)控Bcl-2和ABCC4的表達(dá)影響A549-DDP細(xì)胞系耐藥性的研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是當(dāng)前發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。而肺癌細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是導(dǎo)致肺癌化療失敗、預(yù)后不佳的最主要原因。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2和ABCC4蛋白在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),并可能介導(dǎo)了腫瘤MDR的發(fā)生。本課題旨在觀察miR-125b在A549及其耐藥細(xì)胞株A549/DDP中的表達(dá)差異,探討miR-125b對Bcl-2和ABCC4的mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)控及其意義。

2、　　方法:
　　1.通過miRNA芯片檢測肺腺癌細(xì)胞株A549及其多藥耐藥細(xì)胞株A549/DDP的miRNA表達(dá)譜,找出差異表達(dá)的miRNA。
　　2.通過qRT-PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.通過生物信息學(xué)軟件對miR-125b的靶基因進(jìn)行預(yù)測。
　　4.通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因。
　　5.將miR-125b的模擬物轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞株中,檢測其靶基因蛋白的表達(dá)。
　　6.通

3、過MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-125b對肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP藥物敏感性的影響。
　　7.通過流式細(xì)胞術(shù)分析miR-125b對肺癌多藥耐藥細(xì)胞細(xì)胞株A549/DDP的凋亡敏感性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.通過對A549和A549/DDP中miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以A549細(xì)胞株為對照組,差異值≥1.19(P<0.05)為篩選標(biāo)準(zhǔn),得22條有差異表達(dá)的miRNA,其中耐藥株A549/DDP中上調(diào)的miRNA有

4、14條,下調(diào)的miRNA有8條。
　　2.將表達(dá)差異顯著的兩種miRNA進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測,結(jié)果顯示:miR-125b的表達(dá)在A549/DDP細(xì)胞中較A549細(xì)胞中顯著降低,而mir-24的表達(dá)顯著升高,這一結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果一致,提示miRNA芯片結(jié)果能正確反映A549和A549/DDP細(xì)胞株中miRNA的表達(dá)差異。
　　3.通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)并利用生物信息學(xué)軟件,發(fā)現(xiàn)在miR-125b預(yù)測的靶基因中包括Bcl-2

5、及ABCC4,且兩種基因已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。
　　4.miR-125b通過結(jié)合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的Bcl-23’UTR及ABCC4-23’UTR的靶位點(diǎn),抑制熒光素酶表達(dá),破壞該靶位點(diǎn)可以解除 miR-125b對熒光素酶表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　5.與對照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物的A549/DDP細(xì)胞的Bcl-2和ABCC4蛋白水平明顯降低。
　　6.體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)表明,相對于對照組

6、,轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物的A549/DDP細(xì)胞對不同化療藥物的敏感性顯著增加。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,與對照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物的A549/DDP細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性顯著增加。
　　結(jié)論:
　　1.miRNA在肺腺癌細(xì)胞株A549和多藥耐藥細(xì)胞株A549/DDP中的表達(dá)存在差異,這些差異表達(dá)的miRNA可能參與肺癌多藥耐藥的產(chǎn)生。
　　2.miR-125b可能是通過抑制其