RNA干擾抑制人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549-DDP的ERCC2基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：探討RNA干擾技術(shù)沉默切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因組2(Excision repair crosscom-plimentary group2，ERCC2)在人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP中的表達(dá)，為非小細(xì)胞肺癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：體外設(shè)計(jì)及合成靶向人的ERCC2基因的小干擾RNA(siRNA)，包括：ERCC2-siRNA1、ERCC2-siRNA2、ERCC2-siRNA3、ERCC2-siRNA4和陰性對(duì)照

2、組(NCERCC2-siRNA)，構(gòu)建攜帶ERCC2-shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體，通過(guò)陽(yáng)離子聚合物EndoFectinTM Lenti轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP中，用熒光顯微鏡觀察并測(cè)定轉(zhuǎn)染效率；real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ERCC2mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1、A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，在熒光顯微鏡下觀察到各轉(zhuǎn)染組均有不同比例的eGFP表達(dá)，空白對(duì)照組無(wú)eGFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率最佳的是ERCC2

3、-siRNA2(83.45±3.27％)。2、分別于轉(zhuǎn)染24h、36h、48h后收獲細(xì)胞，用real-time PCR檢測(cè)不同ERCC2-siRNA片段轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后ERCC2mRNA的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染24h后，ERCC2mRNA相對(duì)表達(dá)量在ERCC2-siRNA1組為(0.821±0.112)、ERCC2-siRNA2組為(0.452±0.087)、ERCC2-siRNA3組為(0.591±0.127)、ERCC2-siRN

4、A4組為(0.785±0.135)，其與空白對(duì)照組、NC ERCC2-siRNA組比較，ERCC2mRNA表達(dá)均下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ERCC2-siRNA2組有顯著差異(P<0.01)；轉(zhuǎn)染36h后，ERCC2mRNA相對(duì)表達(dá)量在ERCC2-siRNAl組為(0.818±0.101)、ERCC2-siRNA2組為(0.358±0.097)、ERCC2-siRNA3組為(0.576±0.081)、ERCC2-siRNA4

5、組為(0.772±0.174)，其與空白對(duì)照組、NC ERCC2-siRNA組比較，ERCC2mRNA表達(dá)均下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ERCC2-siRNA2組有顯著差異(P<0.01)；轉(zhuǎn)染48h后，ERCC2mRNA相對(duì)表達(dá)量在ERCC2-siRNA1組為(0.813±0.183)、ERCC2-siRNA2組為(0.293±0.118)、ERCC2-siRNA3組為(0.564±0.086)、ERCC2-siRNA4組為

6、(0.763±0.078)，其與空白對(duì)照組、NC ERCC2-siRNA組比較，ERCC2mRNA表達(dá)均下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ERCC2-siRNA2組有顯著差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：1本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及合成的質(zhì)粒表達(dá)載體可被陽(yáng)離子聚合EndoFectinTMLenti成功轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP中。2 RNA干擾技術(shù)可部分下調(diào)人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP中ERCC2mRNA基因表達(dá)水平。3構(gòu)