水通道蛋白5促進肺癌增殖遷移及參與肺上皮屏障的作用和機制研究.pdf

1、第一部分：水通道蛋白5促進肺癌細胞侵襲遷移的體外實驗及機制研究
　　目的：通過建立穩(wěn)定高表達水通道蛋白5(Aquaporin5，AQP5)的肺癌細胞株(SPC-A1和PC-9)，觀察不同表達水平的AQP5對肺癌細胞增殖、侵襲遷移作用的影響，進一步探討AQP5在肺癌發(fā)生和進展中的潛在作用。
　　方法：構(gòu)建MQP5質(zhì)粒，經(jīng)過測序和基因鑒定。通過陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine2000，L2000)介導的細胞轉(zhuǎn)染，并利用G

2、418(Geneticin)篩選后，建立穩(wěn)定高表達AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌細胞株及相對應的空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株作為對照組。應用real-time PCR和western blot方法及免疫細胞熒光法檢測AQP5的表達。另外，選擇顯著表達AQP5的肺癌細胞株(LTEP-A2)，通過siRNA基因干擾下調(diào)AQP5表達水平，應用real-time PCR和western blot方法評價siRNA對AQP5的干擾下調(diào)效果。進一

3、步檢測細胞水通透性以鑒定穩(wěn)定表達的AQP5的水轉(zhuǎn)運功能。通過細胞遷移、侵襲、劃痕愈合實驗及細胞克隆形成等體外實驗，以及進行細胞生長曲線分析，觀察不同AQP5表達水平對肺癌細胞體外遷移侵襲特性的影響。
　　結(jié)果：利用G418篩選后，建立了穩(wěn)定高表達AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌細胞株及相對應的空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對照細胞株，應用real-time PCR和westem blot及免疫熒光法檢測，表明AQP5細胞株具有穩(wěn)定的AQP5

4、高表達。體外研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高表達AQP5的細胞株具有顯著增強的細胞遷移侵襲及細胞劃痕愈合能力(p<0.01)，但細胞克隆形成實驗及細胞生長曲線分析未顯示顯著差異性(p>0.05)。而siRNA基因干擾下調(diào)AQP5表達后，肺癌細胞的遷移、侵襲及細胞劃痕愈合能力顯著下降(p<0.01)。體外研究還發(fā)現(xiàn)，高表達AQP5細胞株促進細胞的MUC5AC粘蛋白的表達。與對照組比較，高表達AQP5明顯增強肺癌細胞的EGFR/ERK1/2/p3

5、8MAPK信號通路的活性。
　　結(jié)論：AQP5表達促進體外肺癌細胞侵襲遷移作用，EGFR/ERK/p38 MAPK信號通路可能在該機制中發(fā)揮一定的作用，但該作用效應是AQP5介導的直接作用還是間接作用有待進一步研究。
　　第二部分：水通道蛋白5促進肺癌細胞增殖和侵襲遷移的體內(nèi)實驗及機制研究
　　目的：利用第一部分研究已經(jīng)建立穩(wěn)定高表達AQP5的SPC-A1肺癌細胞株，通過建立體內(nèi)腫瘤模型，探討不同表達水平的AQP5對肺

6、癌細胞體內(nèi)侵襲遷移及增殖作用的影響。
　　方法：選擇同齡、同性及體重匹配的裸鼠，分別應用1×106 SPC-A1細胞(包括空白質(zhì)粒對照組和AQP5高表達組)經(jīng)尾靜脈注射制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型，進一步根據(jù)不同時間點分組，制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型。分別在注射不同的時間點(0、2、4、6周)處理各組小鼠，取整體肺組織，通過在體熒光成像系統(tǒng)觀察肺癌細胞在肺部的遷移侵襲。制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型后的2w、4w、6w，分別處理各組部分小鼠，

7、收集肺組織進行石蠟包埋、切片、HE染色病理觀察或冰凍切片后進行熒光顯微鏡觀察肺癌細胞的肺部侵襲轉(zhuǎn)移情況；進一步應用AQP5免疫細胞熒光染色方法觀察鑒定AQP5的蛋白表達；肺組織固定、切片及HE染色后計數(shù)分析肺轉(zhuǎn)移瘤情況。另一組實驗：同樣選擇同齡、同性及體重相匹配的裸鼠，制作皮下成瘤模型：專業(yè)技術(shù)人員應用106 SPC-A1細胞(包括空白對照組和AQP5高表達組)經(jīng)小鼠背部皮下注射后，應用游標卡尺，每隔3天計算檢測瘤塊長(L)、寬(W)，

8、動態(tài)監(jiān)測成瘤大小(0.52xLxW2)，共30天。不同時間點將相應的模型小鼠應用在體熒光成像系統(tǒng)觀察皮下瘤塊生長情況，30天后處死小鼠，收集瘤塊組織進行石蠟包埋、切片、HE染色、病理觀察或冰凍切片后進行熒光顯微鏡觀察。并應用免疫組織化學、免疫熒光技術(shù)進一步檢測。此外，進一步觀察不同的AQP5表達水平對MUC5AC粘蛋白及與腫瘤生長密切相關(guān)的兩個重要指標PCNA、c-myc表達的影響。還有，因小鼠肺部均顯著表達AQP5、AQP1及AQP3

9、，故進一步選擇野生型及相對應的種群-致的AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠，檢測AQP5、AQP1及AQP3基因敲除對小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號通路活性的影響。結(jié)果：制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型后，分別在不同的時間點(2W、4W、6W)通過在體熒光成像系統(tǒng)觀察。與對照組比較，高表達AQP5顯著促進SPC-A1細胞在小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤形成和肺癌細胞的侵襲和分布。病理觀察還發(fā)現(xiàn)：AQP5高表達組的SPC-A1肺癌細胞具

10、有顯著的向外周侵襲特點：更多分布在腫瘤邊緣；而對照組的SPC-A1肺癌細胞則多呈彌漫性分布。免疫細胞熒光染色進一步明確顯示穩(wěn)定篩選的AQP5高表達細胞在體內(nèi)高表達AQP5。此外，皮下成瘤模型實驗顯示：皮下成瘤后2周，AQP5高表達組的瘤塊體積顯著大于對照組，兩組間具有顯著差異性(p<0.05)，而4周時AQP5高表達組的瘤塊體積小于對照組。結(jié)合病理觀察結(jié)果：腫瘤形成晚期(4周后)，AQP5高表達組的瘤塊中心具有更顯著的壞死區(qū)，考慮原因可

11、能是因為其更強的增殖速度所致，中心更顯著的壞死反而影響了整體瘤塊的增大。免疫組織化學及免疫組織化學雙標記染色顯示：體內(nèi)AQP5高表達促進腫瘤組織MUC5AC粘蛋白及PCNA、c-myc的表達。進一步選擇野生型及AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)AQP5基因敲除顯著下調(diào)了小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號通路的活性；而AQP1及AQP3基因敲除對小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號通路的活性未發(fā)現(xiàn)

12、有顯著影響。
　　結(jié)論：本部分體內(nèi)研究進一步表明了高表達AQP5的促進肺癌細胞侵襲遷移及增殖作用，活性增強的EGFR/ERK/p38 MAPK信號通路及增強的MUC5AC粘蛋白表達可能在該機制中發(fā)揮一定的作用。
　　第三部分：水通道蛋白5基因敲除對肺部細菌感染的影響及機制研究
　　目的：利用AQP5基因敲除小鼠(AQP5-/-)及種群相匹配的野生型小鼠(AQP5+/+)作為對照組，制作銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)(P.ae

13、ruginosa，PA)感染的小鼠肺炎模型，探討在細菌感染時，AQP5基因表達對氣道及肺泡上皮屏障功能及肺部細菌的清除作用的影響。
　　方法：選擇野生型(AQP5+/+)及AQP5基因敲除(AQP5-/-)小鼠。實驗組小鼠隨機分為(AQP5+/+)、(AQP5-/-)組。通過氣道滴入法(1x10^6cfu P.aeruginosa)制作急性肺部細菌感染小鼠模型。分別在感染后2小時、6小時處死小鼠，取肺泡灌洗液、血漿、并留取肺組織。

14、血液及肺組織細菌培養(yǎng)檢測；分類計數(shù)肺泡灌洗液(BAL)中的細胞，檢測BAL的蛋白濃度、肺伊文思藍(EBD)含量檢測反映肺泡毛細血管通透性。檢測濕干重比值(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)活性；檢測MCP-1、MIP-2、TNF-α等細胞趨化因子及細胞因子含量；觀察肺組織病理。酶譜法檢測MMP9、MMP2蛋白活性。檢測AQP5基因敲除對肺組織p38MAPK/NF-κB信號通路活性的影響。體外分離培養(yǎng)AQP5+/+及AQP5-/-小鼠的氣道

15、上皮細胞，應用transwell細胞培養(yǎng)板制作氣液界面模型(Air-liquid interface，ALI)，進一步觀察AQP5基因敲除對氣液界面表面液體層厚度的影響。
　　結(jié)果：在肺部綠膿感染小鼠模型的感染早期，AQP5基因敲除顯著增加了細菌血液播散程度。降低了中性粒細胞在遠端氣道及肺泡腔的募集，與野生組比較，AQP5基因敲除后PA感染早期的小鼠肺髓過氧化物酶(MPO)活性顯著降低，AQP5基因敲除降低了血MCP-1、MIP-

16、2的表達水平。在PA感染后4h，與AQP5+/+小鼠組比，在AQP5-/-小鼠肺泡灌洗液(BAL)的蛋白濃度、以及用來評價肺泡毛細血管通透性的伊文思藍(EBD)含量、濕干重比值(W/D)顯著增加。在AQP5-/-組小鼠，MMP9活性在感染后4、6h表現(xiàn)出更為顯著的激活；但在實驗各組均沒有觀察到MMP2活性的明顯變化。AQP5基因敲除減少了肺粘蛋白MUC5AC、MUC5B的mRNA表達。AQP5基因敲除還顯著降低了肺組織的p38 MAPK