早期糖尿病腎病大鼠SonN蛋白的表達及MG132的干預(yù)研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(diabeticmellitus,DM)最常見的微血管病變之一,其發(fā)病機制不清,病理學(xué)特征早期表現(xiàn)為腎小球肥大、系膜增生,后期則以腎小球、腎間質(zhì)纖維化為特征。目前研究認為:轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)與腎纖維化改變密切相關(guān),是引起DN發(fā)病的關(guān)鍵性細胞因子之一。TGF-β／Smad信號通路激活后,使腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-Mesenchy

2、mal Fransition,EMT),細胞外基質(zhì)合成增加,降解減少,致細胞外基質(zhì)不斷集聚,最終引起腎組織纖維化。SnoN蛋白是細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄共抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)SnoN通過與TGF-β下游的Smad蛋白相互作用,抑制TGF-β信號產(chǎn)生的細胞效應(yīng),而SnoN蛋白主要受泛素化降解調(diào)節(jié)。由于SnoN所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的抑制發(fā)生于核內(nèi),且恰好發(fā)生于TGF-β靶基因轉(zhuǎn)錄之前,決定了SnoN在調(diào)控TGF-β／smad信號通路中有重要作用。故本實

3、驗以鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立早期1型糖尿病腎病大鼠模型,用特異性蛋白酶體抑制劑MG132腹腔注射治療作為干預(yù)因素,探討在糖尿病大鼠早期腎病發(fā)病中轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN蛋白表達及與泛素化的關(guān)系,并探討以蛋白酶體抑制劑治療糖尿病腎病的可行性。
　　 方法:1、糖尿病大鼠模型的建立及分組:雄性Wistar大鼠30只,隨機分為糖尿病模型組(20只)和正常對照組(Normal control,NC組,10只)。模型組一次性腹

4、腔注射鏈脲佐菌素STZ(60mg／kg),對照組給予等體積的枸櫞酸緩沖液,成模后隨機分成兩組:糖尿病對照組(Diabetes control,DC組)和糖尿病MG132治療組(Diabetes therapy,DT組)。DT組按0.1mg／kg.d腹腔注射蛋白酶體抑制劑MG132,DC組和NC組每天給予等體積的0.9％生理鹽水腹腔注射。2、6周和8周時收集各組大鼠尿液檢測24小時尿微量白蛋白；心臟采血檢測空腹血糖、胱抑素C(CysC)。

5、3、腎臟組織病理檢查:清潔取腎,石蠟包埋,行HE和Masson染色,觀察腎小球和腎小管間質(zhì)的基本病理改變及纖維化改變的情況。4、免疫組化及蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測各組腎臟組織SnoN蛋白的表達。5、實時熒光定量RT-PCR檢測各組腎臟組織SnoN的mRNA表達。6、統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±S)表示,用單因素方差分析檢測組間差異,兩個組之間進行比較采用q檢驗,以獨立

6、樣本均數(shù)t檢驗比較組內(nèi)差異,以α=0.05為檢驗標準,P<0.05表示差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1、大鼠基本情況:①體重:與NC組比較,模型組體重明顯減輕,DT組體重較DC組增加；各組8周時差異更明顯(P<0.05)。②血糖:NC組血糖在正常水平波動,模型組血糖較NC組明顯升高(P<0.05),DT組與DC組間血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組8周與6周血糖呈相同趨勢,二者間無顯著差異(P>0.05)。③胱抑素C

7、(CysC):各組間差異及8周與6周間比較均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。④24小時尿蛋白定量:與NC組比較,模型組出現(xiàn)微量蛋白尿,以DC組顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組8周與6周呈相同趨勢,二者比較無顯著差異。2、HE、Masson染色:①HE染色顯示:與NC組比較,DC組腎小球體積增大,腎小管腫脹,DT組較DC組腎小球體積減??；8周較6周腎小球體積增大,腎小管腫脹加重,與6周呈相同趨勢。②Masson染色發(fā)現(xiàn):與N

8、C組比較,DC組可見腎間質(zhì)藍色陽性物質(zhì)沉積增多,DT組較DC組減少；8周較6周藍色陽性物質(zhì)沉積增多,與6周呈相同趨勢。3、腎組織SnoN蛋白免疫組化表達:正常NC組腎臟組織可見SnoN蛋白表達,與NC組比較,DC組SnoN蛋白的表達量減少,DT組較DC組表達增多。8周較6周表達量減少,與6周表達趨勢相同。4、wester-blot檢測腎組織SnoN蛋白:SnoN蛋白電泳條帶做灰度值分析得到結(jié)果,NC組檢測有較高水平SnoN蛋白表達,DC

9、組較NC組SnoN蛋白表達明顯減少,MG132治療的DT組較DC組SnoN蛋白表達量增加(P<0.05)；各組8周比6周蛋白表達水平均降低,與6周呈相同趨勢(P<0.05)。5、腎組織SnoN mRNA表達:各組間SnoNmRNA的表達無顯著差異,8周與6周間比較無顯著差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1、早期糖尿病腎病大鼠的SnoN蛋白因泛素化降解而呈低表達。2、蛋白酶體抑制劑可抑制糖尿病腎病時SnoN蛋白的泛素化降解,通過