2型糖尿病腎病差異表達蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、第一部分表面加強激光解吸電離一飛行時間一質(zhì)譜技術(shù)方法的建立和優(yōu)化 目的：建立和優(yōu)化表面加強激光解吸電離一飛行時間一質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)平臺。 方法：取華山醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病。腎病(DN)病人4例、2型糖尿病不伴腎病病人2例、正常人2例的血清和晨尿上清液標本。取病理證實的2型糖尿病腎病病人的腎臟皮質(zhì)標本及正常腎臟皮質(zhì)標本各l例，抽提總蛋白，Bradford法定量。采用WCX2、H4、SAX2、IM

2、AC3-Cu2+四種蛋白質(zhì)芯片，經(jīng)SELDI-TOF-MS測定蛋白質(zhì)譜，摸索處理血清、尿液上清和組織蛋白的最佳蛋白質(zhì)芯片種類和技術(shù)參數(shù)，評估該技術(shù)的穩(wěn)定性和可靠性。 結(jié)果：血清蛋白質(zhì)圖譜顯示蛋白峰最多的為WCX2芯片；尿液上清蛋白質(zhì)圖譜顯示蛋白峰最多的為IMAC3-Cuz+芯片；腎臟皮質(zhì)組織蛋白質(zhì)圖譜顯示蛋白峰最多的為WCX2芯片。WCX2芯片激光強度185，敏感性8；IMAC3-Cu~+芯片激光強度230，敏感性9；SAX2芯

3、片激光強度185，敏感性8；H4芯片激光強度210，敏感性9可獲得相對較好的圖譜。同一芯片內(nèi)蛋白質(zhì)峰強度的變異系數(shù)(Cv)值為16．72％，質(zhì)荷比(m／z)的CV值為0．0236％；不同芯片間蛋白質(zhì)峰強度的CV值為16．76％，m／z的CV值為0．0207％。 結(jié)論：血清蛋白質(zhì)組研究宜選用弱陽離子交換表面芯片，研究尿液上清蛋白質(zhì)組宜選用銅離子螯合表面芯片，腎臟皮質(zhì)蛋白質(zhì)組研究宜選用弱陽離子交換表面芯片。蛋白質(zhì)芯片SELDI-TO

4、F-MS技術(shù)重復(fù)性高、穩(wěn)定性好，是比較理想的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺。選擇最佳參數(shù)及操作過程的標準化對獲得可靠的圖譜十分重要。 第二部分2型糖尿病腎病尿液蛋白質(zhì)指紋圖譜及診斷決策樹模型的建立 目的：篩選尿液上清中2型糖尿病腎病的生物標記物，建立DN診斷決策樹模型，并為探討DN形成的分子機制提供研究基礎(chǔ)。 方法：收集72例2型糖尿病腎病患者、33例2型糖尿病不伴腎病患者和29例正常人晨尿上清，采用銅離子螯合表面芯片(IM

5、AC3-Cu2+)，經(jīng)SELDI-TOF-MS測定得到蛋白質(zhì)指紋圖譜。其中42例DN患者和42例非DN(nonDN)患者組成訓(xùn)練集，通過BiomarkerwizardSoftware3．1比較兩者間尿液上清蛋白質(zhì)譜的差異，利用BiomarkerPatternsSoftware5．0．2建立DN的診斷決策樹模型。其余30例DN患者和20例nonDN患者組成測試集，對模型進行盲法驗證。 結(jié)果：IMAC3-Cu2+芯片建立訓(xùn)練集的蛋白

6、質(zhì)指紋圖譜中，DN與nonDN相比較，17個蛋白峰強度相差2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)，平均m／z為5878．37，¨739．37，11967．94，39943．56，66614．06和79433．58的蛋白峰在DN組中上調(diào)，而平均m／z為2380．42，3031．64，3899．56，4632．28，4647．32，4760．04，4820．6l，4909．51，4966．93，4984．44，5078．44的蛋白峰在DN組

7、中下調(diào)。其中4個蛋白建立了DN診斷模型，盲法驗證該模型準確率86．00％(43／50)，敏感性86．67％(26／30)，特異性85．00％(17／200，陽性預(yù)測值89．66％(26／29)，陰性預(yù)測值80．95％(17／21)。 結(jié)論：DN尿液上清的蛋白質(zhì)指紋圖譜經(jīng)過BiomarkerPatternsSoftware處理后可以得到DN的診斷決策樹模型。模型準確性好，可提供全新的2型糖尿病腎病診斷方法。對差異表達蛋白的進一步研

8、究可能有助于闡明糖尿病腎病的發(fā)病機理。 第三部分2型糖尿病腎病血清蛋白質(zhì)指紋圖譜及診斷決策樹模型的建立 目的：篩選血清中2型糖尿病腎病的生物標記物，建立DN診斷決策樹模型，并為探討DN形成的分子機制提供研究基礎(chǔ)。 方法：收集87例2型糖尿病腎病患者、36例2型糖尿病不伴腎病患者和57例正常人血清，采用弱陽離子芯片CMIO，經(jīng)SELDI-TOF-MS測定得到蛋白質(zhì)指紋圖譜。其中65例DN患者和65例nonDN患者組

9、成訓(xùn)練集，通過BiomarkerwizardSoftware3．1比較兩者問血清蛋白質(zhì)譜的差異，利用BiomarkerPatternsSoftware5．O．2建立DN的診斷決策樹模型。其余22例DN患者和28例nonDN患者組成測試集，盲法驗證模型的準確性。 結(jié)果：CMiO芯片建立訓(xùn)練集的蛋白質(zhì)指紋圖譜中，DN與nonDN相比較，46個蛋白峰強度相差2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義(P

10、z為2505．52，2654．90，3059．07，3253．57，3410．86，3632．77，3668．36，3750．06，4507．37，4558．50，4658．15，4890．31，5078．20，5205．38，5305．65，5318．32，55¨．76，5710．27，5761．叭，5955．42，5973．47和6779．00；而平均m／z為2049．75，2052．8l，2233．97，2235．56，2759．

11、27，2872．63，2936．91，2939．U，3197．31，3266．07，3268．77，3272．09，3402．16，3482．81，3940．55，3961．90，4075．89，4079．94，4096．02，4¨1．08，4301．82，4969．90，5639．47和6194．51的22個蛋白峰在DN組中下調(diào)。其中6個蛋白建立了DN診斷決策樹模型，盲法驗證該模型準確率90．00％(45／50)，敏感性90．91％(