誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙周病涉及牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨三種不同組織，組織學(xué)表現(xiàn)為炎癥浸潤下的牙周膜退縮、牙槽骨吸收以及牙骨質(zhì)的暴露。牙周病牙周重建需要成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞以及牙周成纖維細(xì)胞的共同參與，但是因長期炎癥破壞，牙周病病病變區(qū)域的種子細(xì)胞數(shù)量有限，無法依靠自身種子細(xì)胞達(dá)到組織再生和功能重建，需要大量種子細(xì)胞移植至牙周病變區(qū)域，以滿足牙周組織重建的要求。而在牙周重建過程中，成牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙周纖維的定植以及牙周膜的形成中起著重要作用，因此，選取可向成牙

2、骨質(zhì)細(xì)胞定向分化的種子細(xì)胞，是牙周重建的關(guān)鍵。
　　作為一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞在組織器官損傷修復(fù)以及再生治療方面，表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前，已經(jīng)在許多成人組織中成功分離出了不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且成功應(yīng)用于重建受損組織和細(xì)胞基因治療。在多種間充質(zhì)干細(xì)胞中，胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞來源更原始，多向分化能力更強(qiáng);來源充足，無倫理問題;免疫原性低，可同種異體或異種移植;病毒感染率低，安全性高等方面的優(yōu)點(diǎn)，具有更

3、好的臨床應(yīng)用前景。
　　而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化，需要建立合適的誘導(dǎo)微環(huán)境。在牙周組織發(fā)育過程中，釉基質(zhì)蛋白衍生物起著不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白最主要的活性成分，在牙周發(fā)育及改建過程中，具有促進(jìn)牙骨質(zhì)形成、牙周膜細(xì)胞增殖和骨誘導(dǎo)的能力，國內(nèi)外研究顯示其誘導(dǎo)干細(xì)胞向牙周表型分化效果可靠。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建釉原蛋白腺病毒載體建立體外誘導(dǎo)微環(huán)境，誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，同

4、時(shí)研究誘導(dǎo)非牙源性干細(xì)胞獲得的再生牙周細(xì)胞在正畸力作用下的反應(yīng)機(jī)制，為采用牙周組織工程進(jìn)行牙骨質(zhì)重建提供新的種子細(xì)胞來源，并為再生牙周在正畸力下反應(yīng)機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1.釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建
　　采用人X染色體的釉原蛋白cDNA編碼序列(GenBank Accession No.M86932)作為目的基因，在序列兩端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，全基因合成法合成。利用限

5、制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，將釉原蛋白基因插入到腺病毒輔助載體，然后將釉原蛋白腺病毒輔助載體和腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，采用細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，獲得復(fù)制缺陷型釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體。
　　2.胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定
　　采用酶消化法消化人足月胎盤底蛻膜組織，通過密度梯度離心法獲取胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)及形態(tài)變化;根據(jù)活細(xì)胞線粒體內(nèi)脫氫酶可還原CCK-8成有色的formazan

6、的原理，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力;利用不同細(xì)胞對光線的特征性散射原理，采用流式細(xì)胞儀檢測胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期及干細(xì)胞免疫表型(CD73、CD90、CD105、CD29、CD31、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR);采用成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，證實(shí)盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力。
　　3.釉原蛋白腺病毒載體誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)

7、細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)
　　將釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。對轉(zhuǎn)染后的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞分別在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖活性、體外礦化能力及成牙骨質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型鑒定。同時(shí)，通過沉默F(xiàn)AK基因，研究非牙源性干細(xì)胞獲得的類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在正畸力作用下破骨相關(guān)信號因子M-CSF、RANKL及OPG的反應(yīng)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.采用細(xì)胞內(nèi)同源重組法獲得了高效過表達(dá)

8、釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照腺病毒Ad-EGFP載體，Ad-EGFP證實(shí)腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高。以病毒載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物測序證實(shí)腺病毒載體攜帶的釉原蛋白基因序列與Gen Bank人X染色體的釉原蛋白基因序列完全符合，同時(shí)提取了轉(zhuǎn)染Ad-AMG后293細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)Western-Blot檢測證實(shí)了釉原蛋白的表達(dá)。
　　2.本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈現(xiàn)均一長梭形的成纖維細(xì)胞樣，

9、細(xì)胞呈平行或漩渦狀排列生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型證實(shí)細(xì)胞表達(dá)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞及血細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。多向分化潛能的鑒定，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周以后，可見明顯高亮的礦化結(jié)晶，茜素紅染色表現(xiàn)為深紅色的結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)2周以后，可見細(xì)胞胞漿內(nèi)串珠狀或篩孔狀圓形空泡充滿整個(gè)細(xì)胞，油紅O染色表現(xiàn)為橘紅色的圓泡。
　　3.轉(zhuǎn)染釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體后，在釉原蛋白的誘導(dǎo)下，胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)典型的成

10、牙骨質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，即由原來的長梭形向扁平狀、類圓形、多邊形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞表面有短鈍突起;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞蛋白合成功能增強(qiáng);基因水平及蛋白水平檢測到了礦化因子BSP、OPN、OCN的表達(dá)，對照組為陰性，證明在釉原蛋白的誘導(dǎo)下胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有了礦化能力，同時(shí)RT-PCR及免疫組化檢測到了牙骨質(zhì)特異性蛋白CAP的表達(dá)，證明胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為類成牙骨質(zhì)細(xì)胞。通過進(jìn)一步研究類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在壓應(yīng)力作用下的反應(yīng)機(jī)制發(fā)

11、現(xiàn)，類成牙骨質(zhì)細(xì)胞RANKL及M-CSF的mRNA表達(dá)水平與壓應(yīng)力作用的時(shí)間成正比，隨著壓力加載時(shí)間的延長，RANKL/OPG的比值增大，結(jié)合M-CSF表達(dá)增高，說明在壓應(yīng)力作用下，類成牙骨質(zhì)細(xì)胞具備誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成及分化的功能。在沉默F(xiàn)AK基因后，類成牙骨質(zhì)細(xì)胞RANKL及M-CSF的mRNA表達(dá)水平隨壓應(yīng)力加載時(shí)間延長基本保持不變，但OPG的mRNA表達(dá)水平增高，RANKL/OPG的比值減小，通過干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK基因參與了類成牙

12、骨質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及成熟的過程。
　　結(jié)論:
　　1.細(xì)胞內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建了高效過表達(dá)釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照Ad-EGFP載體。Ad-AMG腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高且能夠正確地表達(dá)釉原蛋白。
　　2.采用膠原酶Ⅱ消化組織并通過密度梯度分選法篩選出的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高，細(xì)胞為均一長梭形的成纖維細(xì)胞樣，呈平行或漩渦狀排列生長。流式細(xì)胞儀及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其典型的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。經(jīng)釉原蛋白

13、誘導(dǎo)后，胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖活性、體外礦化能力以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞特征性相關(guān)基因表達(dá)上，均顯示了一些成牙骨質(zhì)細(xì)胞特性。證實(shí)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在合適的誘導(dǎo)環(huán)境下可以向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。
　　3.誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在壓應(yīng)力作用下具備了誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生、成熟的功能，證明了非牙源性干細(xì)胞誘導(dǎo)向牙周細(xì)胞分化后可以參與正畸治療中牙周組織的改建。同時(shí)，與細(xì)胞骨架重組有關(guān)的FAK基因參與了破骨相關(guān)信號