當(dāng)歸屬藥用植物及藥材的DNA條形碼鑒別研究——兼論DNA條形碼在中藥材鑒定中的原則.pdf

1、中藥鑒定是中醫(yī)藥研究的重大課題，其宗旨是為了解決中藥材“真?zhèn)蝺?yōu)劣”的問題，而傳統(tǒng)的中藥鑒定方法如性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別等由于存在主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性差等方面的缺陷。DNA條形碼作為可用于中藥分子鑒定的新技術(shù)，可以迅速、準(zhǔn)確鑒定物種，待測(cè)樣品只需經(jīng)過DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、基因測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，便可確定物種，能方便地將混品、偽品和正品進(jìn)行區(qū)分，因而DNA條形碼技術(shù)得到中藥鑒定工作者越來越廣泛的關(guān)注。
　　而目前關(guān)

2、于DNA條形碼應(yīng)用于中藥鑒定的研究存在兩方面的局限性：1)均未闡明作為研究對(duì)象的藥材基原與混偽品或非藥用的近緣種的物種間是否進(jìn)化完全，即互為單系，這是藥材分子鑒定的前提，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥用植物和藥材的分子鑒別才有客觀全面的分子尺度。2)多采用原植物新鮮葉片為研究對(duì)象，而不是實(shí)際應(yīng)用中的飲片和藥材，DNA條形碼技術(shù)能否克服藥材材料的特殊性和DNA經(jīng)炮制加工后降解和斷裂等問題，還值得嘗試和驗(yàn)證。
　　本研究選取藥用資源極其豐富的當(dāng)歸屬

3、(Angelica L.)植物及藥典記載藥材白芷、當(dāng)歸和獨(dú)活為研究對(duì)象，基于分子系統(tǒng)學(xué)理論，利用DNA條形碼技術(shù)，選取葉綠體trnH-psbA、matK、rbcL片段和核基因ITS，進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序，基于K2P模型采用鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期達(dá)到以下研究目的：①篩選出當(dāng)歸屬植物DNA條形碼研究最合適的片段；②評(píng)價(jià)DNA條形碼對(duì)當(dāng)歸屬(藥用)植物鑒別能力；③探討DNA條形碼對(duì)藥材市場(chǎng)上當(dāng)歸和獨(dú)活飲片混用及摻偽問題

4、的解決能力；④研究白芷藥材加工炮制過程對(duì)成功進(jìn)行分子鑒別的影響；⑤闡明DNA條形碼對(duì)白芷4個(gè)商品品種(川、杭、祁、禹)進(jìn)行產(chǎn)地鑒別的可能性；⑥初步探討中藥白芷的栽培起源問題。
　　得到結(jié)果如下：
　　1.篩選出ITS為當(dāng)歸屬植物DNA條形碼研究最合適的片段。
　　共得到當(dāng)歸屬25種(含4個(gè)亞種)原植物的384條序列，其中ITS96條，trnH-psbA96條，matK96條，rbcL96條。所選4個(gè)片段的DNA提取、P

5、CR擴(kuò)增和測(cè)序的成功率均為100％，可見在通用性上無差別，但在物種鑒定上，ITS明顯優(yōu)于其余三個(gè)片段。四個(gè)片段的種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離，且從大到小依次為ITS>trnH-psbA>matK>rbcL。其中，ITS序列種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的50倍之多，種間/種內(nèi)遺傳距離界限明顯，可以很好地用于物種間鑒定。
　　在所構(gòu)建的以支持率≥50％為閾值作為成功鑒別物種界限的NJ中，ITS能從25種當(dāng)歸屬原植物中成功鑒別出19種(

6、76％)，而其余三個(gè)片段對(duì)當(dāng)歸屬25種植物的鑒別能力分別為trnH-psbA8種(32％)、matK11種(44％)、rbcL，5種(20％)。因此，本研究推薦ITS為當(dāng)歸屬植物DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)片段。
　　2.DNA條形碼對(duì)當(dāng)歸屬16種藥用植物能夠進(jìn)行有效鑒別。
　　本實(shí)驗(yàn)的25種原植物中，有19種可做藥用。在基于當(dāng)歸屬研究最適宜的條形碼片段ITS序列建立的NJ樹中，19種藥用植物中除了疏葉當(dāng)歸(A。laxifoliata

7、)、紫花前胡(A.decursiva)和骨緣當(dāng)歸(A.cartilaginomarginata var。foliata)無法分開外，其余16種藥用植物均能很好地和其他各種區(qū)分開，當(dāng)歸屬藥典記載藥材白芷、獨(dú)活和當(dāng)歸分別位于NJ樹的上中下三部分，各自進(jìn)化為單系，可作為可靠的鑒別依據(jù)進(jìn)行藥材質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b定。
　　3.DNA條形碼能成功應(yīng)用于當(dāng)歸和獨(dú)活飲片鑒別。
　　基于上述原植物ITS序列建立的NJ樹中當(dāng)歸和獨(dú)活原植物均為單系

8、(支持率100％)，因此可以進(jìn)行分子鑒定。
　　選取全國(guó)10個(gè)地區(qū)的當(dāng)歸飲片共59個(gè)樣品，獨(dú)活飲片共58個(gè)樣品參與實(shí)驗(yàn)，得到92條ITS序列，trnH-psbA103條序列，matK89條序列，rbcL103條序列，PCR成功率/測(cè)序成功率為ITS(92.3％/85.2％)、trnH-psbA(96.6％/91.2％)、matK(88.9％/85.6％)、rbcL(92.3％/95.4％)。4個(gè)片段在當(dāng)歸和獨(dú)活飲片中均能以較高成功

9、率進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，DNA條形碼在當(dāng)歸和獨(dú)活飲片鑒別中具有技術(shù)上的可行性。
　　采用NJ法將25種原植物與當(dāng)歸、獨(dú)活飲片的ITS序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，在當(dāng)歸飲片中，來自9個(gè)地區(qū)(北京、河津、成都、長(zhǎng)沙、淄博、武漢、濱州、周口、七臺(tái)河)的全部當(dāng)歸飲片和來自德州的GDZ-1都與當(dāng)歸原植物(A.sinensis)聚為一支，均為當(dāng)歸正品；而來自德州的樣品GDZ-2、GDZ-4、GDZ-5、GDZ-7、GDZ-8雖與當(dāng)歸原植

10、物聚為一大支，但又獨(dú)自聚為一小支，其與當(dāng)歸原植物相差約40個(gè)堿基，在Genbank上進(jìn)行BLAST，與歐當(dāng)歸(Leristicum officimale)序列完全一致，推測(cè)其為歐當(dāng)歸(市售當(dāng)歸飲片常見偽品之一)。在獨(dú)活飲片中，來自8個(gè)地區(qū)(北京、河津、成都、長(zhǎng)沙、淄博、武漢、周口、七臺(tái)河)的全部獨(dú)活飲片和來自濱州的HBZ-1均與獨(dú)活原植物重齒毛當(dāng)歸(A.biserrata)序列聚為一支，為獨(dú)活正品；來自濱州的樣品HBZ-4、HBZ-6和

11、德州的HDZ-4、HDZ-6、HDZ-8與上述當(dāng)歸偽品歐當(dāng)歸序列完全一致，聚為一支，推測(cè)這些樣品也為歐當(dāng)歸(歐當(dāng)歸在市場(chǎng)上也作獨(dú)活飲片的偽品)。為進(jìn)一步驗(yàn)證DNA條形碼鑒定的準(zhǔn)確性，又對(duì)上述分子鑒定為歐當(dāng)歸的樣品進(jìn)行顯微鑒定，發(fā)現(xiàn)其與正品當(dāng)歸和獨(dú)活顯微結(jié)構(gòu)有較大差異，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，與歐當(dāng)歸顯微結(jié)構(gòu)相似，顯微鑒定結(jié)果與DNA條形碼分子鑒定的結(jié)果一致。
　　4.DNA條形碼對(duì)白芷不同加工程度藥材分子鑒定的探討
　　本研究同樣選取來

12、自上述10個(gè)地區(qū)的白芷飲片共60個(gè)樣品，以及白芷藥材4個(gè)品種的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)遂寧、合肥、安國(guó)、禹州的生藥材(“個(gè)子貨”)共14個(gè)樣品。得到白芷飲片ITS序列7條、trnH-psbA序列15條、rbcL序列29條和matK序列10條，PCR成功率/測(cè)序成功率分別為：ITS(46.7％/25.0％)、trnH-psbA(40.0％/62.5％)、rbcL(51.7％/93.5％)、matK(30.0％/55.6％)；得到白芷生藥材ITS序列12條

13、，trnH-psbA序列11條、rbcL序列12條和marK序列12條，PCR成功率/測(cè)序成功率分別為ITS(100％/85.7％)、trnH-psbA(85.7％/91.7％)、rbcL(92.9％/92.3％)、matK(100％/85.7％)，可以看出白芷藥材4個(gè)片段PCR成功率顯著高于白芷飲片，兩者測(cè)序成功率除rbcL相差不大外，其余三個(gè)片段白芷藥材均高于白芷飲片，可能是白芷飲片經(jīng)加工炮制后，淀粉多而粉性大，提取的DNA質(zhì)量差、

14、雜質(zhì)多的緣故。因此，某些藥材的加工過程對(duì)成功進(jìn)行分子鑒別是有影響的，針對(duì)特殊材料況如何改進(jìn)方法、提高該技術(shù)應(yīng)用的通用性，建立起DNA條形碼用于藥材分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化體系，將是藥材分子鑒定技術(shù)又一個(gè)質(zhì)的飛躍。
　　5.DNA條形碼應(yīng)用于白芷的產(chǎn)地鑒別能力有限
　　為了對(duì)白芷四個(gè)商品品種進(jìn)行產(chǎn)地鑒別，在白芷藥材4個(gè)品種的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)遂寧(川白芷)、合肥(杭白芷)、安國(guó)(祁白芷)、禹州(禹白芷)各選取2-4個(gè)白芷藥材根(“個(gè)子貨”)，得

15、到ITS序列12條，trnH-psbA11條，matK12條，rbcL12條。將所得四個(gè)片段的序列分別比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，各片段4個(gè)產(chǎn)地的白芷藥材序列完全一致，無法鑒別開來，表明DNA條形碼對(duì)白芷產(chǎn)地鑒別是無效的。藥材產(chǎn)地鑒別的實(shí)質(zhì)是生物學(xué)種下居群水平的遺傳分化問題，可以依據(jù)群體遺傳學(xué)和分子譜系地理學(xué)的理論，選用相對(duì)于物種水平具有更快進(jìn)化速率的DNA片段，分析其遺傳分化程度，來尋找作為藥材產(chǎn)地鑒別的分子地理標(biāo)識(shí)。
　　6.DNA條形碼對(duì)白

16、芷栽培起源的研究
　　選取白芷藥材4個(gè)品種共14個(gè)個(gè)體，得到川白芷ITS序列2條、杭白芷和禹白芷各3條、祁白芷4條，將所得共12條ITS序列與當(dāng)歸屬原植物ITS序列共同構(gòu)建NJ樹，得到4個(gè)品種均與興安白芷(A.dahurica)親緣關(guān)系最近，與之前一些學(xué)者認(rèn)為的白芷栽培起源于臺(tái)灣白芷(A.dahurica var.formosana)的觀點(diǎn)不一致。因此，對(duì)白芷的栽培起源問題需要進(jìn)一步進(jìn)行分子譜系地理學(xué)的深入研究。
　　基于上

17、述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究結(jié)論如下：①ITS是對(duì)當(dāng)歸屬(藥用)植物分子鑒別最適合的片段；②利用當(dāng)歸屬DNA條形碼研究最適合的片段ITS可以準(zhǔn)確鑒別當(dāng)歸與獨(dú)活飲片的混偽品。③有些藥材的加工炮制過程對(duì)成功進(jìn)行分子鑒定是有影響的(如本研究中自芷生藥材到飲片的加工過程使分子鑒定的成功率顯著下降)。④DNA條形碼對(duì)白芷產(chǎn)地鑒別是無效的。⑤本研究白芷4個(gè)品種均與興安白芷親緣關(guān)系最近，與之前學(xué)者認(rèn)為的白芷栽培起源于臺(tái)灣白芷的觀點(diǎn)不一致，需要進(jìn)一步進(jìn)行分子譜系

18、地理學(xué)的深入研究。
　　本研究的創(chuàng)新性為：首次建立了DNA條形碼用于藥材鑒定的科學(xué)方法和指導(dǎo)原則，即DNA條形碼用于藥材鑒定的“兩步法”：一、基于分子系統(tǒng)學(xué)理論，利用所需鑒別藥材所在的屬最適合的DNA條形碼片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定所要鑒別藥材原植物物種在整個(gè)屬中系統(tǒng)位置的單系性。二、在物種分子界限得以明確之后，再利用DNA條形碼對(duì)藥材進(jìn)行鑒定，對(duì)于存疑藥材，可以根據(jù)其位于該屬植物中的系統(tǒng)進(jìn)化地位，對(duì)其混淆和替代現(xiàn)象提供科學(xué)的闡釋和