土茯苓及其近緣種藥材的DNA條形碼分子鑒定研究.pdf

1、目的：
　　DNA條形碼技術(shù)是近幾年來(lái)中藥分子鑒定研究的熱點(diǎn)，即運(yùn)用短的、通用DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的分子生物學(xué)方法。當(dāng)前市場(chǎng)上土茯苓的混淆品較多，主要來(lái)源于其近緣種藥材,它們與土茯苓的外觀性狀較為相似，極易混淆。本研究以土茯苓及其近緣種藥材為研究對(duì)象,選取了ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL這5條DNA條形碼候選序列進(jìn)行考察及綜合分析。旨在探究DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于土茯苓及其近緣種藥材的鑒定方法

2、,為將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于中藥鑒別提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　本文考察了34份收集自不同地區(qū)的土茯苓及其近緣種藥材菝葜、土萆薢的核基因組ITS、ITS2序列和葉綠體基因組psbA-trnH、matK、rbcL序列。采用試劑盒法對(duì)這3種藥材的基因組DNA進(jìn)行提取、且考察并優(yōu)化了PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序后，使用CodonCode Aligner V3.7.2（CodonCode Co,USA）序列拼接軟件對(duì)原

3、始測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，切除引物及序列兩側(cè)低質(zhì)量區(qū)。接著利用軟件MEGA6.0對(duì)所得序列進(jìn)行綜合比對(duì)分析，并基于K-2-P模型進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離的計(jì)算。分析比較不同序列種內(nèi)、種間之間的變異關(guān)系，并用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。使用SPSS17.0軟件對(duì)psbA-trnH、matK、rbcL三條DNA片段進(jìn)行序列間的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，“barcoding Gap”檢驗(yàn)，以此作為衡量不同序列之間潛在物種鑒定能力大小的依據(jù)。對(duì)所得

4、序列采用相似性搜索算法中的BLAST方法，通過(guò)比對(duì)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，對(duì)序列之間的同源性進(jìn)行了判定。
　　結(jié)果：
　　從土茯苓與其近緣種藥材基因組 DNA的提取、目標(biāo)序列的 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果來(lái)看,三種藥材的大部分樣品均能成功地提取出 DNA。除 ITS序列之外，ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL序列均能很好的擴(kuò)增出目的片段。除ITS2序列出現(xiàn)大量雜合或結(jié)合問(wèn)題外，psbA-trnH、matK、

5、rbcL序列均能獲得較高質(zhì)量的測(cè)序峰圖。三者的測(cè)序成功率分別為92％、100%、100%。從序列比對(duì)、遺傳距離考察及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果來(lái)看，土茯苓樣品的種內(nèi)變異不明顯，psbA-trnH、matK、rbcL序列的種內(nèi)遺傳距離值分別僅為：0.0018、0.0015、0.0000；而土茯苓與其近緣種藥材的種間差異則較大，psbA-trnH、matK、rbcL序列的種間遺傳距離值分別達(dá)到了0.3151、0.1450、0.0061。由構(gòu)建的系統(tǒng)

6、聚類樹(shù)圖可以看出，不同產(chǎn)地的土茯苓藥材聚成一支，表現(xiàn)為單性系，并與其近緣種明顯分開(kāi)。因此，三條序列均可不同程度地鑒別土茯苓與其近緣種藥材。通過(guò)對(duì)序列間的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和“barcoding Gap”檢驗(yàn)，結(jié)果表明：psbA-trnH、matK、rbcL序列均符合作為DNA條形碼的基本要求。本研究通過(guò)比對(duì)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，對(duì)序列之間的同源性進(jìn)行了判定，結(jié)果表明物種的鑒定成功率均在95%以上。
　　結(jié)論：