AMPKa2-ROS-JNK通路在左旋布比卡因致SH—SY57細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、局麻藥(LA)神經(jīng)毒性反應(yīng)的報(bào)道逐漸增多，已引起臨床高度重視，但目前LA引起神經(jīng)毒性的確切機(jī)理尚未完全闡明。左旋布比卡因(LB)是一新型、長效酰胺類局麻藥，理化性質(zhì)和麻醉效能與布比卡因相似，心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）毒性比布比卡因低，具有廣泛的應(yīng)用前景，但其具體神經(jīng)毒性機(jī)制尚不清楚。嚴(yán)重的LA神經(jīng)毒性表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，然而，越來越多的證據(jù)表明，凋亡已成為神經(jīng)毒性發(fā)生的主要機(jī)制。
　　 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種由新生兒的神經(jīng)嵴衍

2、生的腫瘤，其為發(fā)生于兒童中最常見的實(shí)體瘤。但與其他的人類腫瘤相比，神經(jīng)母細(xì)胞瘤也是自發(fā)衰退率最高的腫瘤之一。SH-SY5Y細(xì)胞源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N.SH的克隆，因其具有正常神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)及分子生物學(xué)特性，多作為研究神經(jīng)細(xì)胞毒性的模型。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族是由MAPK激酶激酶(MAPKKKs，MKKK)、MAPK激酶(MAPKKs, MKK)及其下游激酶MAPKs共同組成。MAPKs家族能夠?qū)?/p>

3、多種細(xì)胞生長因子和促進(jìn)有絲分裂物質(zhì)作出反應(yīng)，把細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部，參與細(xì)胞基質(zhì)、生長因子、炎癥反應(yīng)等重要信號(hào)途徑，介導(dǎo)生長、發(fā)育、分裂分化、凋亡以及細(xì)胞間相互作用等多種細(xì)胞過程。氨基末端激酶(JNK)是MAPKs中三大激酶之一，大量研究顯示，JNK的激活在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。凋亡刺激促使MAPKKKs的激活，進(jìn)而激活MKK，激活的MKK通過磷酸化其下游JNK，促進(jìn)靶基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)凋亡。MKK的激活為JNK

4、通路激活所必須，然而凋亡刺激如何促使MKK的介導(dǎo)并不完全清楚，已有研究報(bào)道JNK通路的激活參與布比卡因與羅哌卡因的神經(jīng)毒性機(jī)制，布比卡因可刺激神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS（ROS）的爆發(fā)誘發(fā)凋亡，而ROS的產(chǎn)生可激活JNK通路，因此我們?cè)O(shè)想LB神經(jīng)毒性機(jī)制與ROS與JNK通路有關(guān)。
　　 單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，活化的AMPK可促進(jìn)分解代謝，抑制合成代謝途徑，以增加三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生。研究表明，在

5、細(xì)胞中AMPK持續(xù)激活可引起ROS大量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡，然而AMPK激活ROS是否參與LB神經(jīng)毒性機(jī)制，目前尚不清楚。
　　 在前期研究中已發(fā)現(xiàn)AMPK與LA，如布比卡因和羅哌卡因觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、釋放密切相關(guān)，然而ROS增多是否通過JNK通路誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡仍未知。目前國內(nèi)LB的臨床研究多集中于藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究，關(guān)于其神經(jīng)毒性機(jī)制研究甚少。藉此我們推測(cè)，LB激活了AMPK通路，導(dǎo)致ROS產(chǎn)量增加，進(jìn)而激活

6、MKKs，進(jìn)一步激活下游JNK通路，導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述，本研究以不同濃度LB處理SH-SY5Y細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞生存率，ROS平均熒光強(qiáng)度和凋亡比率，JNK蛋白及P-JNK蛋白;并應(yīng)用了ROS抑制劑-N-乙酰半胱氨酸（NAC），通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA分子(siRNA)，MKK4與MKK7siRNA，進(jìn)而確定ROS激活JNK的作用靶點(diǎn)。為證實(shí)LB如何增加ROS，將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)本研究組已經(jīng)構(gòu)建和鑒定的重組質(zhì)粒p

7、EGFP-N1-AMPKα2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，研究在AMPKα2高表達(dá)下，SH-SY5Y細(xì)胞受LB刺激后，與未轉(zhuǎn)染組及空載質(zhì)粒組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS、細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率及下游JNK蛋白的變化，以驗(yàn)證上述推測(cè)。
　　 本研究旨在探索LB導(dǎo)致神經(jīng)毒性的確切機(jī)制和原理，為臨床麻醉防治LA神經(jīng)毒性提供理論依據(jù)。
　　 第1章 LB誘發(fā)ROS產(chǎn)生及SH-SY5Y細(xì)胞凋亡
　　 目的:探討LB誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生

8、的ROS水平與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法:SH-SY5Y細(xì)胞體外培養(yǎng)，細(xì)胞共分為12組，C組為對(duì)照組（未經(jīng)藥物處理），L0.5～L2.5組(分別用0.5，1，1.5，2，2.5mM LB的培養(yǎng)液處理24h)，N組(NAC預(yù)處理1h)，N0.5～N2.5組(NAC預(yù)處理1h后，分別用0.5，1，1.5，2，2.5 mM LB的培養(yǎng)液處理24h)。采用CCK-8(Cell Counting Kit)法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀(fl

9、ow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度，Hochest33258檢測(cè)凋亡熒光和FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。細(xì)胞活力，細(xì)胞ROS水平，細(xì)胞凋亡率采用兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析;單獨(dú)效應(yīng)分析時(shí)，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Welch法和Dunnett's T

10、3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 (1)細(xì)胞活力經(jīng)LB處理24h后細(xì)胞活力，細(xì)胞生存率呈現(xiàn)出劑量依賴性降低，L0.5～L2.5組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=907.093，P=0.000)，L2.5組細(xì)胞生存率最低，為（19.50±0.58）％;應(yīng)用NAC預(yù)處理后，N～N2.5組細(xì)胞生存率均升高(F=14.346，P=0.000)。
　　 (2) Hoechst33258染色觀察到經(jīng)過不同

11、濃度的LB處理后，SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞核高度凝集顯現(xiàn)出強(qiáng)藍(lán)色熒光，尤以L2.0組強(qiáng)藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目最多，當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)NAC預(yù)處理后，強(qiáng)藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)目減少。
　　 (3)凋亡率 LB處理各組細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=205.123，P=0.000），其中L2.0組的調(diào)亡率最高，為（24.07±1.12）％;ROS抑制劑NAC預(yù)處理后，凋亡率均降低（F=25.047，P=0.004）。
　　 (4) ROS

12、平均熒光強(qiáng)度 LB處理各組細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=64.098，P=0.000），其中L2.0組ROS平均熒光強(qiáng)度最高為2113.33±188.81;NAC預(yù)處理后，各組ROS平均熒光強(qiáng)度均降低(F=100.423，P=0.023)，其中N2.0組的熒光強(qiáng)度最高，NAC預(yù)處理后降低幅度最小(F=35.960，P=0.004)。
　　 結(jié)論:LB可致SH-SY5Y細(xì)胞呈劑量依賴性細(xì)胞生存率降低與ROS依賴性細(xì)胞凋亡

13、，ROS抑制劑NAC可減輕LB致細(xì)胞壞死及凋亡，LB為2mM時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率最高。
　　 第2章 LB通過ROS/MKK7/JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡
　　 第一部分 MKK4siRNA和MKK7siRNA對(duì)LB致細(xì)胞ROS及凋亡的影響
　　 目的:檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中MKK4與MKK7及ROS之間的聯(lián)系。
　　 方法:通過Q-PCR(Quantitative Polyme

14、rase chain reaction)篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的MKK4siRNA和MKK7siRNA，并且檢測(cè)0，0.5，1，1.5，2，2.5 mMLB作用24h后，MKK4mRNA與MKK7mRNA的表達(dá)。將篩選出的MKK4siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，LB濃度選擇細(xì)胞調(diào)亡率最高的2mM濃度（第一章實(shí)驗(yàn)已證實(shí)）。細(xì)胞分組為:control組為對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染及藥物處理）;NAC組(單純5mMNAC處理1h); MKK4siRNA組（單純轉(zhuǎn)染M

15、KK4siRNA）;LB組（單純2mMLB處理24h）;LB+NAC組(5mM NAC預(yù)處理1h后2mM LB處理24h);LB+MKK4siRNA組(MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后，2mM LB處理24h);LB+NAC+MKK4siRNA組（MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后，5mM NAC預(yù)處理1h后2mMLB處理24h）。MKK7siRNA轉(zhuǎn)染分組同MKK4siRNA。FCM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處

16、理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。MKK4mRNA和MKK7mRNA水平，細(xì)胞ROS水平，細(xì)胞凋亡率采用單因素方差分析(one-way ANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Welch法和Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 (1) MKK4siRNA與MKK7siRNA的篩選分別篩選出沉默效果確切的MKK4siRN

17、A和MKK7siRNA，其中siRNA-MKK4-3組的MKK4mRNA表達(dá)量為0.06±0.10，siRNA-MKK7-1組的MKK7mRNA的表達(dá)量為0.63±0.01。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇siRNA-MKK4-3和siRNA-MKK7-1。
　　 (2) MKK4mRNA與MKK7mRNA的表達(dá)經(jīng)不同濃度LB處理后MKK4mRNA的表達(dá)量各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.661，P=0.660），MKK7mRNA表達(dá)量各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)

18、差異(F=1799.050，P=0.000)，LB=2mM時(shí)，MKK7mRNA表達(dá)量最高205.63±5.19。
　　 (3)細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組調(diào)亡率相比，MKK4siRNA組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.601)，LB組與LB+MKK4siRNA組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000);與對(duì)照組凋亡率相比，MKK7siRNA組凋亡率降低(P=0.005)，與LB組相比，LB+MKK7siRNA組凋亡率降低(P=0.003)。
　　

19、 (4) ROS熒光強(qiáng)度與對(duì)照組ROS平均熒光強(qiáng)度相比，MKK4siRNA組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.095），LB組與LB+MKK4siRNA組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.171);與對(duì)照組ROS平均熒光強(qiáng)度相比，MKK7siRNA組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)，LB組與LB+MKK7siRNA組相比亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)，LB+NAC組低于LB組（P=0.015），LB+NAC+MKK7siRNA組低于LB組(P=0.02

20、4)。
　　 結(jié)論 LB可激活ROS/MKK7通路進(jìn)而導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。
　　 第二部分 MKK4siRNA和MKK7siRNA對(duì)LB致JNK及P-JNK蛋白表達(dá)的影響
　　 目的:檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中ROS與MKK及JNK之間的聯(lián)系。
　　 方法:Western blot檢測(cè)不同濃度LB作用于細(xì)胞后JNK及P-JNK蛋白表達(dá)。MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分組為:control組為

21、對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染及藥物處理）;NAC組（單純5mM NAC處理1h）;MKK4siRNA組(單純轉(zhuǎn)染MKK4siRNA); LB組(單純2mM LB處理24h); LB+NAC組(5mM NAC預(yù)處理1h后2mM LB處理24h);LB+MKK4siRNA組(MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后，2mMLB處理24h); LB+NAC+MKK4siRNA組（MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后，5mM NAC預(yù)處理1h后2mM LB處理24h）。Western

22、 blot檢測(cè)各組細(xì)胞P-JNK蛋白表達(dá)。MKK7siRNA轉(zhuǎn)染后分組同MKK4siRNA。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。JNK及P-JNK蛋白表達(dá)水平采用單因素方差分析(one-wayANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Welch法和Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 (1) LB處

23、理后JNK，P-JNK表達(dá)細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的LB處理24h，各組JNK蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=685.027，P=0.000），與對(duì)照組對(duì)比，LB為0.5，1，1.5，2，2.5mM時(shí)的JNK蛋白表達(dá)降低（P值均為0.000），與LB為2mM相比，LB為0.5，1，1.5mM時(shí)JNK蛋白表達(dá)較高（P值均為0.000），LB為2.5mM時(shí)JNK蛋白表達(dá)較低;各組P-JNK蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1449.76，P=0.000），對(duì)照組

24、對(duì)比，LB為0.5，1，1.5，2，2.5mM時(shí)的P-JNK蛋白表達(dá)較高（P值均為0.000），與LB為2mM相比，LB=0.5，1，1.5mM時(shí)P-JNK蛋白表達(dá)較低（P值均為0.000），LB=2.5mM時(shí)P-JNK蛋白表達(dá)降低。綜上所述，LB=2mM時(shí)JNK磷酸化程度最高。
　　 (2) MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后P-JNK表達(dá)MKK4siRNA轉(zhuǎn)染后，多重比較示，對(duì)照組與MKK4siRNA相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)

25、，LB組與LB+MKK4siRNA組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.548)，LB+NAC組P-JNK蛋白表達(dá)水平低于LB組。
　　 (3) MKK7siRNA轉(zhuǎn)染后P-JNK表達(dá) MKK7siRNA轉(zhuǎn)染后，各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2209.632，P=0.000），多重比較示，對(duì)照組與MKK7siRNA相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，對(duì)照組P-JNK表達(dá)水平高于MKK7siRNA組，LB+MKK7siRNA組低于LB組(P=0

26、.000)，LB+NAC+MKK7siRNA組低于LB+NAC組(P=0.000)和LB+MKK7siRNA組(P=0.000)。
　　 結(jié)論:LB可通過ROS/MKK7/JNK通路進(jìn)而引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。
　　 第3章上調(diào)AMPKa2可促進(jìn)LB通過ROS/MKK7JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡
　　 目的:探討過表達(dá)AMPKa2是否可介導(dǎo)LB通過ROS/MKK7/JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞凋

27、亡。
　　 方法:將質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2和空載質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞株，細(xì)胞分組為:control組（未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒）;pEGFP-N1組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N1）;pEGFP-N1-AMPKα2組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2);LB組（未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒后2mMLB處理24h）;LB+pEGFP-N1-AMPKα2組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2后2mMLB處理24

28、h);LB+pEGFP-N1組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1后2mMLB處理24h)。Western blot法檢測(cè)鑒定AMPKα2表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞內(nèi)ROS含量，Western blot法檢測(cè)鑒定P-JNK表達(dá)水平。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。AMPKα2，P-JNK蛋白吸光度值，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，ROS含量，細(xì)胞

29、凋亡率采用兩因素析因設(shè)計(jì)資料方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2的SH-SY5Y細(xì)胞組，其AMPKα2表達(dá)上調(diào);2mM LB處理后，與空載質(zhì)粒pEGFP-N1細(xì)胞組及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS含量提高，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增多，P-JNK蛋白水平升高;而空載質(zhì)粒pEGFP-N1細(xì)胞組與未轉(zhuǎn)