左旋布比卡因經(jīng)線粒體Cl-通道和p38MAPK途徑致細(xì)胞凋亡.pdf

1、局部麻醉藥簡稱局麻藥，為臨床區(qū)域阻滯和疼痛治療中的常用藥物，但該類藥物存在直接或間接的神經(jīng)毒性作用，這早已被其發(fā)展史及藥理與毒理學(xué)研究所證實。隨著神經(jīng)阻滯麻醉的廣泛應(yīng)用，局麻藥引起的神經(jīng)毒性反應(yīng)逐漸引起了臨床工作者的重視，相關(guān)的研究報道也逐漸增多。許多研究發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)毒性與局麻藥引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其確切機(jī)制仍未完全闡明。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡時產(chǎn)生特征性形態(tài)改變，在DNA降解之前，線粒體膜功能發(fā)生紊亂，內(nèi)膜跨膜電

2、位消失，線粒體內(nèi)蛋白酶活化物釋放，激發(fā)各種凋亡相關(guān)的代謝變化。細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的爆發(fā)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞急性損傷的主要因素之一。ROS在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蓄積時，可破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡，損傷線粒體膜。此外，ROS亦可直接與蛋白、脂質(zhì)、核酸等發(fā)揮作用使其失去功能，起中間信使的作用，進(jìn)一步引發(fā)神經(jīng)損傷。研究表明，布比卡因可使Schwann細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　 細(xì)胞凋亡

3、主要經(jīng)過兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其一是死亡受體途徑，細(xì)胞表面的死亡受體通過其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的死亡配體結(jié)合，將細(xì)胞外凋亡信號傳入細(xì)胞內(nèi)，激活caspase-8，而后激活caspase-3，從而啟動細(xì)胞凋亡;其二是線粒體途徑，氧自由基、鈣超載等刺激因素可使線粒體通透性增加，線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-inducing factor, AIF)，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡

4、。細(xì)胞凋亡與線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔（Mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放有關(guān)。mPTP由電壓依賴性陰離子通道（Voltage dependent anion channel，VDAC）、腺苷酸運輸體(Adeninenueleotide translocator, ANT)和親環(huán)素D（Cyclophilin D，Cyp-D）構(gòu)成。Cl-可以從開放的VDAC通道進(jìn)入線粒體內(nèi)，并能引

5、起線粒體膜損傷和膜電位下降，導(dǎo)致分布在線粒體膜間的細(xì)胞色素C、AIF等促凋亡分子釋放。研究表明，Cl-通道阻斷劑(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonic acid disodium，DIDS)可特異性阻斷VDAC通道，抑制ROS產(chǎn)生、減少細(xì)胞凋亡和壞死。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸殘

6、基的蛋白激酶，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-Activated Protein Kinase，p38MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員之一，許多應(yīng)激性刺激如H2O2等均能使p38MAPK信號途徑激活。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號途徑通過控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性，影響多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)一氧化氮和細(xì)胞骨架蛋白的合成，參與應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過

7、程。Lirk等發(fā)現(xiàn)p38MAPK抑制劑4-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-(4-pyddyl)-1 H-imidazole(SB203580)可抑制利多卡因誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞軸突退變。
　　 本科研小組前期研究發(fā)現(xiàn)，布比卡因通過干擾氧化磷酸化和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I使ATP生成減少，AMPK持續(xù)激活，引起ROS的爆發(fā)性產(chǎn)生并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體的陰離

8、子通道VDAC和p38MAPK可能與布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。布比卡因可通過使細(xì)胞內(nèi)ROS增多，一方面直接激活胞漿p38MAPK途徑，引起細(xì)胞凋亡;一方面導(dǎo)致線粒體的VDAC通道開放，Cl-進(jìn)入線粒體增多，線粒體基質(zhì)腫脹和膜電位下降，線粒體的通透性進(jìn)一步增高，釋放出細(xì)胞色素C、AIF等促凋亡因子引起細(xì)胞凋亡，同時釋放出更多的ROS，進(jìn)一步激活p38MAPK蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 左旋布比卡因(Lvobupivaca

9、ine，LB)是一種長效酰胺類局麻藥，理化性質(zhì)和麻醉效能與布比卡因相似，兩藥的心血管和神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)一直是臨床高度關(guān)注的問題。研究已證明，LB為布比卡因的左旋體，其心血管毒性顯著低于布比卡因，但兩藥的神經(jīng)毒性比較，目前仍存在爭議。LB誘發(fā)的神經(jīng)毒性是否與ROS產(chǎn)生和介導(dǎo)有關(guān)？LB是否也通過激活p38MAPK途徑和線粒體Cl-通道誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡？目前尚不清楚。
　　 本研究擬先從細(xì)胞水平，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段，比較不

10、同濃度LB誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS和細(xì)胞凋亡的作用，并通過使用Cl-通道阻斷劑DIDS及p38MAPK拮抗劑SB203580，以揭示LB引發(fā)細(xì)胞凋亡的通路是否與線粒體Cl-通道被激活和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。然后通過整體動物實驗，研究不同濃度LB對大鼠脊神經(jīng)ROS增多和細(xì)胞凋亡的影響，同時也通過使用DIDS和SB203580來探討LB致大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是否與線粒體Cl-通道被激活和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，以

11、驗證細(xì)胞實驗的結(jié)果并探討體外與體內(nèi)實驗的異同性，為臨床中防治LB引起的神經(jīng)毒性提供一定的理論依據(jù)。
　　 第1章不同濃度左旋布比卡因誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS和細(xì)胞凋亡
　　 目的: 在細(xì)胞水平探討不同濃度LB誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS的水平與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法: 以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，分為6組:0mmol/L LB組（對照組）、0.5mmol/L LB組（LB0.5組）、1mmo

12、l/L LB組（LB1.0組）、1.5mmol/L LB組(LB1.5組)、2mmol/L LB組（LB2.0組）、2.5mmol/L LB組（LB2.5組）。各組細(xì)胞在含O、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mM LB的培養(yǎng)液中分別孵育1、2、3、4、5、6h，觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度。各組細(xì)胞在含不同濃度LB的培養(yǎng)液中孵育4h，用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，并采用FCM檢測細(xì)胞凋亡。
　　 計

13、量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同藥物處理組在各時間點測得的ROS水平比較采用析因設(shè)計資料的方差分析。細(xì)胞活力及凋亡率均采用完全隨機(jī)單因素方差分析，組間比較采用LSD法;若方差不齊采用welch校正法，組間比較采用Dunnett's T3法。
　　 結(jié)果: 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)不同濃度LB處理后，各濃度組細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸增高，3～4h達(dá)高峰，尤以LB2.0組4h的峰值最高

14、（209.04±1.15），之后ROS水平出現(xiàn)下降趨勢。LB0.5、LB1.0、LB1.5和LB2.0各處理組的ROS含量隨著LB濃度的增加而增加，但LB2.5組ROS含量在2h后均低于LB2.0組;CCK-8法檢測經(jīng)不同濃度LB處理4h后的細(xì)胞活力，細(xì)胞活力呈現(xiàn)出劑量依賴性的降低，LB為2.5mM時細(xì)胞活力最低，為（23.15±1.60）％;流式細(xì)胞儀檢測到LB各組間細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)，其中LB為2mM的調(diào)亡率最

15、高，(為32.57±1.59)。
　　 結(jié)論: LB可引起SH-SY5Y細(xì)胞呈濃度依賴性的ROS升高、caspase-3活化和細(xì)胞凋亡增多、活力降低。2mM LB在4h細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生最多，細(xì)胞凋亡率最高，呈典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　 第2章左旋布比卡因經(jīng)線粒體Cl-通道和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡
　　 目的: 在細(xì)胞水平探討LB致SH-SY5Y細(xì)胞ROS增多，對細(xì)胞線粒體Cl-通道和p

16、38MAPK的影響，以揭示線粒體Cl-通道和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LB致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法: 將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為4組:無預(yù)處理組(non-pretreated組)、DIDS組、SB203580組、DIDS+SB203580組。DIDS組、SB203580組和DIDS+SB203580組細(xì)胞分別經(jīng)50μmol/L DIDS、10μmol/L SB203580、50μmol/L DIDS+1

17、0μmol/LSB203580預(yù)處理30min后用含2.0mmol/LLB的培養(yǎng)液處理，non-pretreated組用含2mmol/LLB的培養(yǎng)液處理。各組細(xì)胞經(jīng)LB處理4h用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5，5'，6，6，-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylbenzimidazole-carbocyanide iodine，JC-1)檢測線粒體膜電位，Westernb

18、lot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平，激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-熒光強(qiáng)度，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，F(xiàn)CM和Hochest33258檢測細(xì)胞凋亡率。同時，未用LB處理的各組細(xì)胞在相同時間點檢測上述相同的指標(biāo)作為對照。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。細(xì)胞ROS含量、Cl-熒光強(qiáng)度、線粒體膜電位變化、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、p38和p-p38MAPK蛋白

19、表達(dá)量采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析。組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果: LB培養(yǎng)4h后，DIDS組和DIDS+SB203580組細(xì)胞內(nèi)ROS水平低于non-pretreated組(P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜JC-1熒光強(qiáng)度比值顯示，DIDS組和DIDS+SB203580組分別為0.82±0.01和0.79±0.01，均高于non-p

20、retreated組（0.52±0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-濃度顯示， DIDS組和DIDS+SB203580組的Cl-濃度均低于non-pretreated組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。Western blot顯示，DIDS組和DIDS+SB203580組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平均低于non-pretreated組。MTT檢測顯示，DIDS組和SB203580組的細(xì)

21、胞活力高于non-pretreated組(P＜0.01)，但均低于DIDS+SB203580組(P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率顯示，LB處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、SB203580組和non-pretreated組分別為23.42±1.58％、12.73±0.96％、24.53±0.93％和38.17±0.22％。Hoechst33258染色法檢測顯示，經(jīng)LB處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、

22、SB203580組和Non-pretreated組的凋亡率分別為22.88±1.13％、12.45±0.74％、24.68±0.85％和37.87±0.99％。提示經(jīng)LB處理后DIDS組、DIDS+SB203580組和SB203580組的凋亡率均低于non-pretreated組(P＜0.01)，DIDS+SB203580組的凋亡率低于SB203580組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論: LB可通過影響線粒體Cl-通道和激活p38

23、 MAPK途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。LB引起SH-SY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生增多后，不但直接活化p38 MAPK途徑，引起細(xì)胞凋亡，并且導(dǎo)致線粒體VDAC通道開放， Cl-流入線粒體內(nèi)，線粒體膜功能受損和膜電位下降，產(chǎn)生和釋放更多的ROS，進(jìn)一步激活p38 MAPK蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 第3章不同濃度左旋布比卡因?qū)Υ笫蠹顾枭窠?jīng)細(xì)胞ROS產(chǎn)量和細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的: 在整體動物水平比較不同濃度LB對大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞ROS產(chǎn)

24、量和細(xì)胞凋亡的影響，評價不同濃度LB對大鼠脊髓神經(jīng)損傷的程度。
　　 方法: 成年健康雄性SD大鼠60只，體重220～250g。隨機(jī)分成5組，每組12只:正常對照組（C組）、溶媒組（D組）、0.5％LB組（LB0.5組）、2.0％LB組（LB2.0組）和5.0％LB組（LB5.0組）。C組、D組、LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組分別鞘內(nèi)注射生理鹽水、2％二甲基亞砜(DMSO)、0.5％、2.0％、5.0％LB20μl。給

25、完藥后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每組大鼠分出6只(n=6)做感覺運動功能觀察，分別于鞘內(nèi)給藥前（基礎(chǔ)狀態(tài)）、給藥后10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、1d、2d、3d測定甩尾反應(yīng)潛伏期TFL并用最大效應(yīng)百分比MPE表示，并進(jìn)行后肢運動功能MF評分。3d后大鼠用4％多聚甲醛灌注，取脊髓L4-L5節(jié)段，行HE染色病理切片，免疫組化檢測caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)以及TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡。每組大鼠另外分出的6只(n

26、=6)不做感覺運動功能觀察，給藥1d后即用生理鹽水灌注，取脊髓L4-L5節(jié)段，ELISA檢測脊髓ROS水平。
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。MPE值、運動功能評分比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。脊髓ROS水平、caspase-3的陽性細(xì)胞計數(shù)和TUNEL凋亡細(xì)胞計數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）

27、。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠鞘內(nèi)注藥后MPE的比較，C組和D組的MPE不隨時間變化，且在任意時間點處兩組的MPE值均無統(tǒng)計學(xué)差異。各組內(nèi)的不同時點進(jìn)行比較顯示，LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組MPE在鞘內(nèi)注藥后10min均達(dá)到高峰后呈下降趨勢，LB0.5組和LB2.0組分別于注藥后4h和8h恢復(fù)至基線水平，而LB5.0組則于2d方恢復(fù)至基線水平。
　　 2.各組大鼠

28、鞘內(nèi)注藥后MF評分的比較，顯示C組和D組的MF評分不隨時間變化，且在任意時間下兩組的MF值均無統(tǒng)計學(xué)差異。各組內(nèi)的不同時間點進(jìn)行比較顯示， LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組MF評分在鞘內(nèi)注藥后10min均達(dá)到高峰后呈下降趨勢，LB0.5組在20min MF基本恢復(fù);LB2.0組在1h MF基本恢復(fù)，而LB5.0組則在4h MF恢復(fù)。
　　 3.HE染色病理切片觀察，C組、D組和LB0.5組脊髓神經(jīng)元胞體形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本未見

29、異常;LB2.0組脊髓背角淺層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，可見細(xì)胞核裂解;LB5.0組脊髓背角淺層神經(jīng)元凋亡最為明顯，凋亡細(xì)胞單個散在分布于組織中，可見凋亡小體。
　　 4.各組大鼠脊髓ROS檢測顯示，C組和D組大鼠脊髓ROS水平?jīng)]有明顯變化。同C組比較，LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組大鼠脊髓ROS水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組任意兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均

30、有P＜0.01）。
　　 5.各組大鼠IHC檢測顯示，C組和D組大鼠脊髓神經(jīng)組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)沒有明顯變化。同C組比較，LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組大鼠脊髓背角淺層caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組任意兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均有P＜0.01）。
　　 6.各組大鼠脊髓TUNEL細(xì)胞陽性率檢測顯示，C組和D組大鼠脊

31、髓神經(jīng)組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)沒有明顯變化。同C組比較，LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組大鼠脊髓背角淺層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LB0.5組、LB2.0組和LB5.0組任意兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均有P＜0.01）。
　　 結(jié)論: 以2％DMSO作為溶媒對大鼠脊髓神經(jīng)組織沒有神經(jīng)損傷和神經(jīng)毒性作用;HE染色病理切片、IHC染色caspase-3陽性細(xì)胞和TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞發(fā)

32、現(xiàn)，大鼠脊髓LB損傷后細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在背角淺層神經(jīng)細(xì)胞;LB可引起大鼠脊髓神經(jīng)組織濃度依賴性的ROS增加，脊髓背角淺層caspase-3和TUNEL陽性細(xì)胞率增加，提示大鼠脊髓背角淺層神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，造成神經(jīng)損傷，導(dǎo)致一定程度的感覺功能障礙，濃度越高感覺功能恢復(fù)延遲越明顯。
　　 第4章SB203580和DIDS對大鼠脊神經(jīng)細(xì)胞左旋布比卡因損傷后細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的: 在整體動物水平研究SB203580和DID

33、S對大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞LB損傷后細(xì)胞凋亡的影響，探討LB神經(jīng)毒性的作用機(jī)制。
　　 方法: 成年健康雄性SD大鼠，體重220～250g。取鞘內(nèi)置管成功大鼠48只，隨機(jī)分成4組，每組12只。LB組、DIDS+LB組、SB203580+LB組、(DIDS+SB203580)+LB組。LB組用微量注射器緩慢鞘內(nèi)注射0.9％生理鹽水20μL，2h之后用微量注射器緩慢(10')鞘內(nèi)注射5.0％LB20μl; DIDS+LB組經(jīng)股靜脈以程控微

34、量泵給予14mg/Kg的DIDS[4ml/(Kg·h)]2h，之后鞘內(nèi)緩慢注射5.0％LB20μl; SB203580+LB組鞘內(nèi)注射0.1％SB203580(溶于2％DMSO)20μl，2h之后鞘內(nèi)緩慢注射5.0％LB20μl;(DIDS+SB203580)+LB組先鞘內(nèi)注射0.1％SB20358020μl，之后經(jīng)股靜脈以程控微量泵給予14mg/Kg的DIDS2h，然后鞘內(nèi)緩慢注射5.0％LB20μl。給完藥后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每

35、組動物分出6只(n=6)做感覺運動功能觀察，大鼠分別于鞘內(nèi)給藥后30min、1h、2h、4h、8h、12h、16h、1d、2d、3d測定甩尾反應(yīng)潛伏期TFL并用最大效應(yīng)百分比MPE表示，并進(jìn)行后肢運動功能MF評分。3d后大鼠用4％多聚甲醛灌注，取脊髓L4-L5節(jié)段，行HE染色病理切片，免疫組化檢測caspase-3、caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)以及TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡。每組大鼠另外分出的6只(n=6)不做感覺運動功能觀察，給藥1

36、d后即用生理鹽水灌注，取脊髓L4-L5節(jié)段，ELISA檢測脊髓ROS水平，Western blot檢測p38MAPK和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)。
　　 另取鞘內(nèi)置管成功大鼠48只，隨機(jī)分成4組，每組12只。NS組、DIDS+NS組、SB203580+NS組、(DIDS+SB203580)+NS組。NS組用微量注射器緩慢鞘內(nèi)注射NS20μL，2h之后再用微量注射器緩慢(10')鞘內(nèi)注射NS20μL; DIDS+NS組經(jīng)股靜脈以

37、程控微量泵給予14mg/Kg的DIDS[4ml/(Kg·h)]2h，之后鞘內(nèi)緩慢注射NS20μl; SB203580+NS組鞘內(nèi)注射0.1％SB203580（溶于2％DMSO）20μl，2h之后鞘內(nèi)緩慢注射NS20μl;(DIDS+SB203580)+NS組先鞘內(nèi)注射0.1％SB20358020μl，之后經(jīng)股靜脈以程控微量泵給予14mg/Kg的DIDS2h，然后鞘內(nèi)緩慢注射NS20μl。給完藥后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每組動物分出6只(n

38、=6)做感覺運動功能觀察3d后處死取材，6只(n=6)則給藥1d后即處死取材。未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠在相同時間點檢測上述相同的指標(biāo)作為對照。
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。MPE值、運動功能評分比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。脊髓ROS水平、caspase-3、caspase-9的陽性細(xì)胞計數(shù)、p38MAPK和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平比較、凋亡細(xì)胞計數(shù)比較采用單

39、因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠鞘內(nèi)注藥后MPE各組內(nèi)的不同時點進(jìn)行比較，LB組、DIDS+LB組、SB203580+LB組和(DIDS+SB203580)+LB組MPE在鞘內(nèi)注藥后30min～2h均處于高峰平臺而后呈下降趨勢，DIDS+LB組、SB203580+LB組和(DIDS+SB2

40、03580)+LB組的恢復(fù)比LB組快，而(DIDS+SB203580)+LB組的恢復(fù)又比DIDS+LB組和SB203580+LB組快，四組均于注藥后2d方恢復(fù)至基線水平。
　　 2.各組大鼠鞘內(nèi)注藥后MF評分的比較顯示，各組大鼠后肢運動功能的恢復(fù)在各時間點沒有顯著性差異， LB組、DIDS+LB組、SB203580+LB組和(DIDS+SB203580)+LB組MF均在4h恢復(fù)。
　　 3.HE染色病理切片觀察，LB組脊

41、髓組織神經(jīng)元胞體形態(tài)和結(jié)構(gòu)破壞明顯，胞漿尼氏小體有減少、破裂，可見細(xì)胞核裂解;DIDS+LB組和SB203580+LB組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞;(DIDS+SB203580)+LB組則損傷較輕，胞漿尼氏小體形態(tài)尚完整，胞核和胞漿比例也較前三組正常。
　　 4.未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓ROS水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.058，P=0.981)，提示此時各組間ROS水平?jīng)]有差別;鞘內(nèi)注射LB后各組大鼠脊髓ROS水平差異顯

42、著(F=321.229，P=0.000)，提示此時各組間ROS水平不同，DIDS+LB組、(DIDS+SB203580)+LB組ROS水平低于SB203580+LB組和LB組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而鞘內(nèi)注射LB組大鼠脊髓組織ROS水平均較未注射組水平顯著升高（均有P＜0.01）。
　　 5.未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.024，P=0.995);鞘內(nèi)注射LB后

43、各組大鼠脊髓caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)差異顯著（F=21.735，P=0.000），提示此時各組間caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)不同，(DIDS+SB203580)+LB組caspase-3陽性細(xì)胞計數(shù)低于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。而鞘內(nèi)注射LB組大鼠脊髓背角淺層神經(jīng)組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均較未注射組顯著升高（均有P＜0.01）。
　　 6.未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓神經(jīng)組織caspase-9陽性

44、細(xì)胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.019，P=0.996);鞘內(nèi)注射LB后各組大鼠脊髓背角淺層神經(jīng)組織caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)差異顯著(F=66.166，P=0.000)，提示此時各組間caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)不同，DIDS+LB組、(DIDS+SB203580)+LB組均低于SB203580+LB組和LB組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。而鞘內(nèi)注射LB組大鼠脊髓背角淺層caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)均較未注射組顯著升高（均

45、有P＜0.01）。
　　 7.未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓p38MAPK蛋白表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.941，P=0.439)，鞘內(nèi)注射LB各組間p38MAPK蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.936，P=0.442）;未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.306，P=0.757);鞘內(nèi)注射LB后各組大鼠脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平差異顯著(F=243.117

46、，P=0.000)，提示此時各組間p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平不同，(DIDS+SB203580)+LB組、SB203580+LB組p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平低于DIDS+LB組和LB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而鞘內(nèi)注射LB組大鼠脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平均較未注射組顯著升高（均有P＜0.01）。
　　 8.未鞘內(nèi)注射LB的各組大鼠脊髓TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.170，P=0.95

47、1);鞘內(nèi)注射LB后各組大鼠脊髓背角淺層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異顯著(F=23.998，P=0.000)，提示此時各組間TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)不同，(DIDS+SB203580)+LB組TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)低于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而鞘內(nèi)注射LB組大鼠脊髓背角淺層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均較未注射組顯著升高（均有P＜0.01）。
　　 結(jié)論: LB可能通過干擾氧化磷酸化和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I使ATP生成減

48、少，引發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性增多，直接激活p38 MAPK途徑，引起細(xì)胞凋亡;并可導(dǎo)致線粒體Cl-通道開放，線粒體膜功能受損而產(chǎn)生和釋放更多的ROS，促使p38 MAPK蛋白激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時也可能因為內(nèi)外膜剝離造成線粒體損傷，釋放出細(xì)胞色素C和促凋亡誘導(dǎo)因子等，激活caspase-9基因，進(jìn)而激活caspase-3基因形成活化復(fù)合物，最終引起細(xì)胞凋亡。因此，可認(rèn)為LB引起的大鼠脊髓神經(jīng)毒性機(jī)制可能與線粒體的Cl-通道和p