大鼠AOC3基因在重病失血性休克及復(fù)蘇中的表達(dá)與功能.pdf

1、[背景]
　　 盡管對休克的復(fù)蘇、救治已有三百余年的研究歷史，但面對重癥失血性休克時使用傳統(tǒng)治療方法仍然效果不佳、死亡率高。重癥失血性休克的病理生理學(xué)特點是:微循環(huán)持續(xù)低灌流和頑固性低血壓。如何找到新的治療位點以改善這兩個病理生理改變是治療重癥休克的關(guān)鍵。本實驗小組前期對重癥失血性休克大鼠肝臟中差異基因背景進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷同樣條件的重癥失血性休克后，存活與死亡的大鼠肝臟中AOC3基因水平差異明顯。
　　 含銅胺氧化酶3

2、(AOC3)基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為血管粘附蛋白-1(VAP-1)，VAP-1抗原的克隆揭示其屬于氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)。VAP-1具有雙重功能，作為粘附分子其能在炎癥下誘導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，作為胞外酶又可對伯胺類物質(zhì)進(jìn)行氧化脫胺反應(yīng)。既往研究表明VAP-1在白細(xì)胞滲出、粘附級聯(lián)反應(yīng)、糖代謝調(diào)節(jié)、血管損傷等方面都具有重要意義。但AOC3基因與失血性休克之間的關(guān)系尚未見報道。
　　 [目的]
　　 1、

3、明確重癥失血性休克及復(fù)蘇過程中大鼠小腸及血清中AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)和酶活性變化;
　　 2、明確缺氧條件下大鼠腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIMEC)中AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)及誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能的變化;
　　 3、明確抑制VAP-1/SSAO活性對缺氧條件下RIMEC中VAP-1誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能的影響;
　　 4、明確抑制VAP-1/SSAO活性對重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠小腸微循

4、環(huán)及粘膜損傷和大鼠24小時生存率的影響。
　　 [方法]
　　 1、建立重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型（股動脈2.0ml/kg·min勻速放血，維持35-45mmHg休克血壓1小時，1/2總失血量的血液+3/2總失血量的乳酸林格氏液復(fù)蘇），采集休克前、休克1小時后、復(fù)蘇1小時后的小腸組織及血清;
　　 2、采用realtime RT-PCR測量小腸組織中的AOC3基因的mRNA值，Western blot測量小腸組

5、織中的VAP-1含量，免疫組化檢測小腸組織中VAP-1的表達(dá)，ELISA試劑盒法測量血清中可溶性VAP-1（sVAP-1）的含量和VAP-1/SSAO活性;
　　 3、制備AOC3過表達(dá)腺病毒并將其轉(zhuǎn)染RIMEC，realtime RT-PCR、Western Blot分別檢測常氧及缺氧條件(95％N2和5％CO2培養(yǎng)24小時)下、正常及腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中AOC3基因及VAP-1的水平;
　　 4、使用白細(xì)胞-內(nèi)

6、皮細(xì)胞粘附試劑盒分別檢測正常及加入SSAO抑制劑(1mg/ml2-溴乙胺)、常氧及缺氧條件下、正常及腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC與大鼠白細(xì)胞粘附情況;
　　 5、復(fù)制重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型，復(fù)蘇時加用不同濃度(20 mg/kg、50mg/kg、100 mg/kg)的2-溴乙胺或等體積的生理鹽水，比較復(fù)蘇1小時后各組血清中VAP-1/SSAO活性;
　　 6、復(fù)制重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型，復(fù)蘇時實驗組加用20mg/k

7、g2-溴乙胺，比較實驗組和生理鹽水對照組中復(fù)蘇1小時及24小時后的血壓，活體顯微鏡檢測復(fù)蘇1小時后小腸微循環(huán)情況（微血管管徑及毛細(xì)血管流速），檢測復(fù)蘇24小時后小腸粘膜損傷情況（Chiu's評分）和小腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡情況(TUNEL檢測)，比較大鼠24小時生存率。
　　 [結(jié)果]
　　 1、重癥失血性休克時小腸組織AOC3基因的mRNA值、VAP-1蛋白水平以及血清sVAP-1水平、VAP-1/SSAO活性均較假休克組

8、顯著升高（P值均＜0.001），復(fù)蘇后上述各值較休克組下降，但仍顯著高于假手術(shù)組，小腸組織免疫組化顯示VAP-1主要表達(dá)于小腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿中;
　　 2、缺氧條件下RIMEC中AOC3基因的mRNA值較常氧條件下顯著升高(P＜0.001)，且在AOC3基因腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中升高更明顯(P＜0.001)，VAP-1蛋白的變化同AOC3基因變化一致;
　　 3、缺氧條件下RIMEC中VAP-1誘導(dǎo)

9、的白細(xì)胞粘附功能較常氧條件下顯著升高(P=0.026)，2-溴乙胺能顯著抑制VAP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附功能，無論是在正常RIMEC中(P=0.001)還是在AOC3基因腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中(P＜0.001);
　　 4、相對于生理鹽水對照組，使用20mg/kg的2-溴乙胺就能顯著抑制重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠血清VAP-1/SSAO活性(P=0.005)，并隨著2-溴乙胺濃度上升而抑制程度上升;
　　 5、相對于

10、生理鹽水對照組，使用20mg/kg的2-溴乙胺能使重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠血壓（復(fù)蘇1小時和24小時后）顯著升高（P值分別0.010和0.039），能顯著提高小腸真毛細(xì)血管血流速度(P=0.024)，而對毛細(xì)血管前微動脈和毛細(xì)血管后微靜脈的管徑無顯著影響（P值分別為0.184和0.237），對小腸粘膜損傷的Chiu，s評分有顯著改善(P=0.022)，對小腸粘膜上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)有顯著改善(P=0.002)，能提高休克大鼠24小時生

11、存率（90％對60％）。
　　 [結(jié)論]
　　 1、體內(nèi)實驗證實重癥失血性休克能刺激AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達(dá)、酶活性顯著增高，而液體復(fù)蘇能減輕這種增高;
　　 2、體外實驗證實缺氧條件能刺激AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達(dá)及誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能顯著增高，VAP-1/SSAO抑制劑能顯著抑制這種誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能上的增高;
　　 3、使用VAP-1/SSAO抑制劑能顯著改善重癥失血性休克及