線粒體DNA遺傳變異與我國西南地區(qū)漢族人群肺癌易感相關(guān)性實驗研究.pdf

1、肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是對人類生存和健康構(gòu)成極大威脅的惡性腫瘤之一。肺癌的病因及發(fā)病機制迄今尚未明確。研究表明，雖然吸煙和吸入石棉是肺癌的兩大主要危險因素，但個體遺傳易感性、遺傳與環(huán)境的相互作用等因素與個體罹患肺癌的風(fēng)險性亦密切相關(guān)。
　　 目前關(guān)于肺癌遺傳易感機制的研究主要集中于核DNA(nuclear DNA，nDNA)編碼基因的遺傳變異，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)個與肺癌易感性有關(guān)的nDNA編碼基因，包括CYP2

2、E1，CYP1A1，RCC1等，而從nDNA基因組以外的遺傳體系探討肺癌易感性機制的研究較少。線粒體具有維持機體能量代謝、生成ROS和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。線粒體通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)生成維持機體生命活動所需的ATP、熱量，并產(chǎn)生副產(chǎn)物一活性氧(reactive oxygen species，ROS)。人體內(nèi)約85%的內(nèi)源性ROS都是由線粒體生成的，在產(chǎn)生ROS的同時，線粒

3、體通過調(diào)節(jié)有絲分裂信號傳導(dǎo)通路促進細(xì)胞分裂增殖，通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeability transition pore，mtPTP)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。因此，線粒體在機體生命活動中起著極其重要的作用。
　　 線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是人類除nDNA以外細(xì)胞內(nèi)唯一存在的遺傳物質(zhì)。研究顯示，mtDNA的突變率是nDNA的10倍以上。mtDNA產(chǎn)生突變的核心環(huán)節(jié)是

4、氧化損傷，而吸煙是人體產(chǎn)生氧化損傷的一大暴露因素，它通過增加ROS生成量，加劇機體氧化損傷的程度。長期反復(fù)的慢性氧化損傷可誘發(fā)mtDNA損傷，導(dǎo)致mtDNA點突變、插入突變及缺失突變。隨著mtDNA氧化損傷和mtDNA序列突變的不斷累積，最終導(dǎo)致受損細(xì)胞OXPHOS紊亂，并引起線粒體相關(guān)疾病。研究表明，吸煙引起的氧化損傷所致mtDNA拷貝數(shù)代償性增加與重度吸煙者(吸煙量：≥30包年)罹患肺癌的風(fēng)險性密切相關(guān)。因此，我們推測，mtDNA遺

5、傳變異與個體罹患肺癌的風(fēng)險性密切相關(guān)。為了檢驗該假設(shè)，本研究通過對比分析mtDNA單倍型和mtDNA822bp片段缺失在我國西南地區(qū)漢族442例肺癌患者和504例健康志愿者中的分布特征，以探討mtDNA遺傳變異與肺癌遺傳易感性之間的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 (1)研究對象：肺癌組(病例組)(n=442)來自于新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科2007年9月-2008年12月期間收治的經(jīng)組織學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺癌的患者，非肺癌組(對

6、照組)(n=504)來自于2007年11月-2008年12月期間在新橋醫(yī)院健康體檢中心接診的無肺癌病史的體檢者。病例組和對照組研究對象均來自于我國西南地區(qū)。
　　 (2)采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)和mtDNA高變區(qū)Ⅰ(HVS-Ⅰ)序列測定方法，研究mtDNA單倍型在病例組和對照組中的分布特征，探討mtDNA單倍型與肺癌易感性之間的關(guān)系。
　　 (3)采用序列測定明確mtDNA缺失片段大小及其

7、位置，采用常規(guī)PCR和巢式PCR檢測mtDNA片段缺失在研究群體中的分布，探討該mtDNA片段缺失與吸煙以及mtDNA單倍型之間的關(guān)系及其潛在的臨床意義。
　　 主要結(jié)果：
　　 1、吸煙者在肺癌組中所占的比例較對照組顯著增高。根據(jù)吸煙包年數(shù)對946名研究對象進行分層，結(jié)果顯示：輕度吸煙者(0包年≤吸煙量<30包年)在肺癌組和對照組中所占比例分別為57.69%和88.69%，重度吸煙者(吸煙量≥30包年)在肺癌組和對照組

8、中所占比例分別為42.31%和11.31%，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.001)。
　　 2、Pearson's卡方檢驗或Fisher's精確檢驗顯示：mtDNA單倍型G、M7、M8在肺癌組中出現(xiàn)的頻率顯著性高于對照組(p值分別為p<0.001，p=0.001，和p=0.003)，而單倍型D、F出現(xiàn)的頻率則顯著降低(p值分別為p<0.001和p=0.001)。多因素邏輯回歸分析結(jié)果顯示，mtDNA單倍型D、F攜帶者罹患肺癌的風(fēng)

9、險顯著降低(OR=0.465，95%CI=0.329-0.656，p<0.001；OR=0.622，95％ CI=0.425-0.909，p=0.014)，而mtDNA單倍型G、M7的攜帶者罹患肺癌的風(fēng)險顯著增加(OR=3.924，95％ CI=1.757-6.689，p<0.001；OR=2.037，95%CI=1.253-3.312，p=0.004)。
　　 3、本研究在分析本研究群體的mtDNA單倍型時，偶然發(fā)現(xiàn)部分研究對

10、象出現(xiàn)mtDNA片段缺失。測序結(jié)果顯示，該缺失片段大小為822bp，位于mtDNA15587-16412nps之間，由于該缺失片段的兩端(15587-15591nps和16408-16412nps)均存在一段5bp的短重復(fù)序列(CTCCG)，因而無法判定該缺失片段的具體起止位點。
　　 4、根據(jù)吸煙包年數(shù)對研究群體進行分層后，線性相關(guān)檢驗(linear-by-linearassociation test)顯示，mtDNA822b

11、p缺失率隨著吸煙量的增加呈增高趨勢(p<0.001)。Pearson's卡方檢驗或Fisher's精確檢驗顯示，mtDNA822bp缺失在重度吸煙者(吸煙量>30包年)中的頻率顯著高于輕度吸煙者(0包年<吸煙量≤30包年)(p<0.001)。多因素邏輯回歸分析顯示，吸煙是mtDNA822bp缺失的危險因素(OR=6.540，95% CI=3.247-13.174，p<0.001)；此外，在調(diào)整性別、年齡以及吸煙習(xí)慣等影響因素后，多因素邏

12、輯回歸分析顯示，肺癌組個體發(fā)生mtDNA822bp缺失的風(fēng)險是對照組個體的3.8倍(OR=3.776，95% CI=2.662-5.355，p<0.001)。
　　 5、女性非吸煙者mtDNA822bp缺失率顯著高于男性非吸煙者(p<0.001)；在排除年齡因素的影響后，多因素邏輯回歸分析顯示，女性非吸煙者發(fā)生mtDNA822bp缺失的風(fēng)險是男性非吸煙者的5.8倍(OR=5.814，95% CI=3.279-10.309，p<0

13、.001)。
　　 6、Pearson's卡方檢驗或Fisher's精確檢驗顯示：mtDNA單倍型D攜帶者其mtDNA822bp片段缺失率顯著高于其他mtDNA單倍型攜帶者(p<0.001)；在調(diào)整年齡、性別、吸煙習(xí)慣等因素的影響后，多因素邏輯回歸分析顯示，mtDNA單倍型D是發(fā)生mtDNA822bp片段缺失的危險因素(OR=1.906，95% CI=1.359-2.738，p<0.001)。
　　 7、在男性吸煙者和非

14、吸煙者間進行比較發(fā)現(xiàn)，mtDNA單倍型D是男性吸煙者發(fā)生mtDNA822bp片段缺失的危險因素(OR=2.752，95% CI=1.699-4.456，p<0.001)，mtDNA單倍型G是男性非吸煙者發(fā)生mtDNA822bp缺失的危險因素(OR=3.906，95％CI=1.381-12.255，p=0.017)。
　　 結(jié)論
　　 1、mtDNA單倍型與肺癌易感性密切相關(guān)：mtDNA單倍型D和F是個體罹患肺癌的保護因素