人Scl-70抗原207-765位氨基酸多肽的表達(dá)、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的 抗Scl-70抗體是系統(tǒng)性硬化癥(SSc)的血清特異性抗體。Scl-70抗原的生化本質(zhì)為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，具有四個結(jié)構(gòu)域，其中核心結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域含有抗體識別的主要優(yōu)勢表位。本文利用基因工程技術(shù)，重組表達(dá)人Scl-70抗原207－765位氨基酸多肽融合蛋白，免疫印跡(WB)法鑒定抗原性，并以親和純化后的重組多肽作為抗原基質(zhì)，建立酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測自身免疫病患者血清中抗Scl-70抗體。 方法

2、 根據(jù)編碼Scl-70抗原的核酸序列，設(shè)計并合成一對寡聚核苷酸引物，以人胎盤cDNA第一鏈為模板，采用高保真DNA聚合酶，PCR法擴(kuò)增獲得編碼Scl-70抗原第207至第765位氨基酸的基因片段。利用普通Taq酶對PCR產(chǎn)物3’末端加“A”的特性，將擴(kuò)增獲得的基因片段3’末端加“A”后與PGEM-T easy載體連接。酶切后將目的基因定向插入原核表達(dá)載體Pet-42b，完成重組質(zhì)粒構(gòu)建。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE

3、3)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，經(jīng)Ni<'2+>-NTA親和層析純化后WB法鑒定抗原性，建立ELISA方法檢測協(xié)和醫(yī)院免疫科血清庫中36份SSc和20份其他結(jié)締組織病患者血清抗Scl-70抗體，并比較了其中22例SSc患者血清抗Scl-70抗體與肺間質(zhì)纖維化的相關(guān)性。 結(jié)果 重組融合蛋白在宿主菌中獲得可溶性表達(dá)，WB實驗表明其能與標(biāo)準(zhǔn)抗Scl-70抗體陽性血清反應(yīng)，而與正常血清和其他抗血清無交叉反應(yīng)。ELISA檢測結(jié)果表明，在36

4、例SSc患者血清中，有8例呈陽性，其中5例經(jīng)天然抗原免疫雙擴(kuò)散(DID)法檢測也為陽性；在28例ELISA法檢測為陰性的血清中有1例經(jīng)天然抗原DID法檢測呈陽性。重組抗原ELISA法檢測的陽性率為22.2％，高于天然抗原DID法(16.7％)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。20份其他結(jié)締組織病(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡8例、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎5例、干燥綜合征3例、炎性肌病4例)患者的血清檢測結(jié)果均為陰性。22例SSc患者中抗Scl-70抗體陽性組的肺間質(zhì)纖維