安吉白茶高氨基酸相關(guān)基因分離及鑒定.pdf

1、安吉白茶是在浙江省安吉縣海拔800米的高山上發(fā)現(xiàn)的自然突變體茶樹，其葉片具有階段性返白現(xiàn)象。對(duì)安吉白茶葉片氨基酸組分及含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)安吉白茶葉片在階段性返白過程中，氨基酸含量差異顯著，白期總氨基酸含量比綠期高2～3倍。該研究利用安吉白茶為材料，通過對(duì)其返白前后差異表達(dá)基因的克隆分析，試圖探明安吉白茶在白化期氨基酸含量呈現(xiàn)明顯提高的分子機(jī)理。其主要研究結(jié)果如下： 建立了從富含多酚與多糖的茶樹葉片中制備高質(zhì)量總RNA的方法，即

2、在傳統(tǒng)Tri-Reagent法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，在沉淀RNA時(shí)先加入1/2倍體積的高鹽，再加入1/2倍體積的異丙醇，以除去茶多糖的干擾；同時(shí)使整個(gè)操作過程在低溫環(huán)境下迅速連貫的進(jìn)行，以防止褐化效應(yīng)并減少RNA酶的污染。利用改良的方法所提取的茶樹總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，可見2條清晰的28sRNA和18sRNA譜帶，且前者明顯強(qiáng)于后者，表明RNA完整性好，無明顯降解現(xiàn)象。 應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(Suppression subt

3、ractive hybridization，SSH)分離安吉白茶白期葉與綠期葉差異表達(dá)基因，成功構(gòu)建了安吉白茶白期葉與綠期葉的正、反向消減文庫(kù)。從正反向消減文庫(kù)中隨機(jī)挑選160個(gè)陽(yáng)性克隆，通過菌落PCR和斑點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定，共獲得80個(gè)差異表達(dá)明顯的cDNA片段，其大小在200bp～800bp之間。 將80個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，其結(jié)果表明這些基因片段與光呼吸、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、脅迫

4、反應(yīng)、糖代謝等多個(gè)代謝途徑相關(guān)。其中，1-5基因推測(cè)編碼的氨基酸序列與擬南芥絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列有83％的相似性。1-9基因推測(cè)編碼的氨基酸序列與擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列有90％的相似性。2-13基因推測(cè)編碼的氨基酸序列與鈣調(diào)熱激蛋白具有94％的相似性。 采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該3個(gè)基因在安吉白茶白期與綠期葉片中的表達(dá)水平進(jìn)行分析的結(jié)果表明，1-5基因和1-9基因在白期葉片中表達(dá)水平較綠期高，2-13

5、基因在綠期葉片中表達(dá)水平較白期高。 根據(jù)本論文的研究結(jié)果，可以初步推測(cè)安吉白茶階段性返白是受鈣調(diào)熱激蛋白的調(diào)控，其茶氨酸與其它氨基酸在白期超常富集的原因可能是絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶過表達(dá)的結(jié)果。每年春茶早期，當(dāng)環(huán)境溫度較低時(shí)，鈣調(diào)熱激蛋白基因被抑制表達(dá)，而絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因得以超表達(dá)，從而促進(jìn)了氨基酸及茶氨酸的生物合成，表現(xiàn)出白期葉片中氨基酸與茶氨酸的水平較高；而在春茶中、后期，隨著