蟾毒它靈對惡性膠質(zhì)瘤的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分，蟾毒它靈在體外對人膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用的評價
　　目的：在體外培養(yǎng)環(huán)境下,了解蟾毒它靈對人膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用及IC50濃度區(qū)間,初步了解蟾毒它靈對U87細胞侵襲能力和細胞周期的影響。
　　方法：運用XTT法測定蟾毒它靈對U87、U251膠質(zhì)瘤細胞系生長抑制的量-時-效關(guān)系。運用XTT法分別測定不同濃度蟾毒它靈作用于原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細胞Jz001和JZ002以及人膠質(zhì)瘤細胞株U87和U251的72小時生長

2、抑制率。正規(guī)幾率單位法計算蟾毒它靈對每種細胞的IC50。TRANSWELL法測定不同濃度蟾毒它靈對U87細胞侵襲能力的影響。流式細胞技術(shù)測定不同濃度蟾毒它靈對U87細胞周期的影響。
　　結(jié)果：藥物干預后24、48和72小時,各濃度蟾毒它靈對人膠質(zhì)細胞的增殖抑制作用趨勢接近。在體外培養(yǎng)環(huán)境下,不同濃度的蟾毒它靈作用72小時對人腦膠質(zhì)瘤細胞生長抑制活性有較大差異,對Jz001的IC50為0.063ug/ml,對JZ002的IC50為0

3、.084ug/ml,對U87的IC50為0.071ug/ml,對U251的IC50為0.145ug/ml。2-5ug/ml的蟾毒它靈就能明顯降低U87細胞的侵襲能力。2-2ug/ml蟾毒它靈作用24小時可以使U87細胞G2期和S期細胞比例明顯提高。
　　結(jié)論：蟾毒它靈在體外對多種人膠質(zhì)瘤細胞均有很強的增殖抑制活性,蟾毒它靈對人膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用有明顯的劑量依賴性而時間相關(guān)性不明顯。U87細胞的侵襲能力和蟾毒它靈的濃度呈負相關(guān)

4、。蟾毒它靈可以通過G2/M期、S期細胞周期阻滯對膠質(zhì)瘤細胞發(fā)揮增殖抑制作用。
　　第二部分，蟾毒它靈對人膠質(zhì)瘤動物模型的抗腫瘤效果研究
　　目的：建立U87原位種植動物模型。了解經(jīng)血管給藥后,不同時間點蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)的分布情況；比較蟾毒它靈和陽性對照藥物替莫唑胺對U87荷瘤小鼠的療效優(yōu)劣。
　　方法：采用高效液相色譜法測定經(jīng)尾靜脈給藥后不同時間點(15min、30min、1小時、2小時、4小時、8小時、16小時和2

5、4小時)的小鼠腦組織內(nèi)蟾毒它靈含量的變化；立體定位注射技術(shù)建立U87原位種植裸鼠模型,并分為對照組、實驗組和陽性對照組。對照組(n=15)給予每周兩次尾靜脈注射藥物溶劑、實驗組(n=14)給予每周兩次尾靜脈注射6mg/Kg蟾毒它靈,陽性對照組(n=18)給予每日腹腔注射82.5mg/Kg替莫唑胺連續(xù)5天。治療開始后定期觀察小鼠體重變化,通過定期的增強磁共振掃描了解不同干預下活體內(nèi)腫瘤生長的差異,根據(jù)生存情況繪制生存曲線,比較不同干預對荷

6、瘤小鼠生存時間的影響。組織學和免疫組化染色驗證不同干預對腫瘤的作用。
　　結(jié)果：成功建立了U87原位異體種植裸鼠模型。經(jīng)尾靜脈給藥后不同時間點蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)的含量測定表明,靜脈給藥后蟾毒它靈能通過血腦屏障進入腦組織,并維持在0.1μ g/g的濃度之上超過16小時。陽性對照組小鼠在治療開始后1周左右的時間內(nèi),平均體重呈進行性下降,停用TMZ后體重逐漸恢復,對照組和實驗組小鼠的平均體重在術(shù)后2周左右開始出現(xiàn)進行性下降。定期的增強磁

7、共振掃描發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組腫瘤逐漸增大,而陽性對照組在4周內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯強化的腫瘤信號。根據(jù)荷瘤小鼠生存情況繪制生存曲線發(fā)現(xiàn),對照組中位生存時間為21天,實驗組中位生存時間25天,比較兩組生存時間存在統(tǒng)計學差異(P=0.038),陽性對照組觀察超過4周無組內(nèi)樣本死亡。
　　結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定的U87原位異體種植裸鼠模型,該模型方法便捷,成瘤率穩(wěn)定,是很好的評價化療藥物體內(nèi)效果的動物模型。靜脈注射蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)分布良好,并且能夠

8、長時間維持有效的治療濃度。增強磁共振掃描是一種安全直觀的活體觀察荷瘤小鼠腦內(nèi)腫瘤生長情況的方法。蟾毒它靈單獨應用可以延長荷瘤小鼠的生存時間。
　　第三部分，蟾毒它靈對人膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制作用機理的研究
　　目的：初步探索蟾毒它靈抑制膠質(zhì)瘤生長的作用機理以及膠質(zhì)瘤對其耐藥的機制。
　　方法：采用TUNEL/PI雙染法測定蟾毒它靈引起的DNA片段化；JC-1染色檢測蟾毒它靈對線粒體膜電位的影響；Western-Blot技術(shù)

9、檢測蟾毒它靈對細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3pro-form、caspase-8、caspase-9、p53以及survivin含量的影響。對第二部分中實驗組和對照組動物腦組織切片行IHC染色,觀察P糖蛋白(P-Gp)的表達是否存在差異。
　　結(jié)果：蟾毒它靈作用24小時即可引起膠質(zhì)瘤細胞線粒體膜電位下降和DNA的片段化；蟾毒它靈作用36小時后即可使膠質(zhì)瘤細胞進入不可逆的凋亡,細胞內(nèi)凋亡執(zhí)行酶Caspase-3前體的含量隨蟾毒

10、它靈的濃度升高而下降；代表死亡受體通路激活的Caspase-8和代表線粒體通路激活的Caspase-9的含量隨蟾毒它靈的濃度增高而增高,p53和survivin在U87細胞中的表達相對較低,蟾毒它靈的濃度對這兩種蛋白表達的影響不明顯。IHC染色發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈干預后膠質(zhì)瘤細胞P-糖蛋白(P-Glycoprotein)的表達較對照組增高。
　　結(jié)論：蟾毒它靈短時間作用就可以誘導膠質(zhì)瘤細胞進入凋亡過程,并且死亡受體通路和線粒體通路都參與了