MiR-9在膠質(zhì)瘤惡性行為中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】
　　膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。根據(jù)膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)特點(diǎn)和臨床標(biāo)準(zhǔn),世界衛(wèi)生組織(WHO)將其分為I-IV級(jí)。I級(jí)膠質(zhì)瘤在兒童多發(fā),且一般認(rèn)為 I級(jí)膠質(zhì)瘤為良性腫瘤,可通過手術(shù)切除治愈,很少發(fā)生惡性進(jìn)展;相比之下II、III級(jí)膠質(zhì)瘤具有一定侵襲性且惡性程度更高,預(yù)后較差;惡性程度最高且預(yù)后最差的是IV級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM),根據(jù)其是否由低級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)展而來,可

2、將其分為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
　　MicroRNAs(miRNA)為普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的內(nèi)源性小片段非編碼RNA分子,可通過與多個(gè)靶基因信使RNA(mRNA)結(jié)合從而調(diào)控基因的表達(dá)。miRNAs在進(jìn)化中高度保守性,提示其可能在生命功能的諸多方面發(fā)揮重要作用。與腫瘤相關(guān)的miRNAs可根據(jù)其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用,分為促癌miRNAs和抑癌miRNAs。目前的研究主要集中于挖掘與正常組織或細(xì)胞系相比,腫瘤中m

3、iRNAs的差異表達(dá),進(jìn)而研究其功能及尋找下游調(diào)控靶基因。已有大量研究表明miRNAs在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤中發(fā)生差異表達(dá),這些miRNAs在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　MiR-9在動(dòng)植物中高度保守,且已被證實(shí)在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而,其在膠質(zhì)瘤中的功能卻不明確。MiR-9在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有何特點(diǎn)?其異常表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有何影響?MiR-9又是通過調(diào)節(jié)哪些重要靶基因來影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過程?在膠質(zhì)瘤

4、中miR-9異常表達(dá)的機(jī)制是什么?上述問題的研究將有助于探索膠質(zhì)瘤的惡性行為機(jī)制,探究將miR-9作為治療靶點(diǎn)的可行性,為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了新策略。
　　【目的】
　　探究膠質(zhì)瘤臨床樣本及其膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-9的表達(dá)情況;研究miR-9在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中的生物學(xué)作用;尋找及鑒定 miR-9調(diào)節(jié)的功能相關(guān)靶基因;尋找調(diào)控 miR-9的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因素,為膠質(zhì)瘤的預(yù)防、早期診斷以及治療靶點(diǎn)選擇提供新的理論依據(jù)

5、。
　　【方法】
　　1.通過qRT-PCR檢測(cè)臨床組織樣本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中 miR-9的表達(dá)水平;2.體外 A172細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-9 mimic和U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-9 inhibitor分別上調(diào)和下調(diào)miR-9的表達(dá),通過MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、血管生成實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)分析miR-9對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞多種生物學(xué)行為的影響;3、運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)miR-9潛在的功能靶基因,分子克

6、隆技術(shù)將預(yù)測(cè)靶基因3’UTR結(jié)合區(qū)域連接至PGL3報(bào)告基因質(zhì)粒;4、利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定miR-9直接調(diào)控靶基因,并用qRT-PCR、Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)在mRNA和蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證;5、利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)對(duì)miR-9調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子及H3K27組蛋白甲基化,qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與H3K27組蛋白甲基化狀態(tài);6.采用siRNA干擾技術(shù)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒下調(diào)/上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白去甲基化酶,分析mi

7、R-9的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】
　　1.qRT-PCR分析結(jié)果顯示,與正常腦組織相比,在膠質(zhì)瘤組織樣本中 miR-9的表達(dá)水平增高;與正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比,miR-9在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均高表達(dá),其中在膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中相對(duì)表達(dá)較低,在U251細(xì)胞系中表達(dá)較高;與正常腸上皮細(xì)胞相比,miR-9在結(jié)直腸癌中表達(dá)較高;而與正常腎上皮細(xì)胞相比,在腎癌中miR-9呈現(xiàn)低表達(dá),表明miR-9的表達(dá)具有組織特異性;2.A172細(xì)胞轉(zhuǎn)染

8、mimic后可有效上調(diào)miR-9的表達(dá)水平,MTT結(jié)果顯示miR-9促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞周期分析過表達(dá)miR-9組細(xì)胞進(jìn)入S期細(xì)胞增多,G1期細(xì)胞數(shù)減少;上調(diào)miR-9表達(dá)后,A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增高,過表達(dá)miR-9組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC,增強(qiáng)了HUVEC細(xì)胞體外成管能力;而同時(shí)對(duì)U251細(xì)胞系轉(zhuǎn)染inhibitor后,細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞周期S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少,G1期細(xì)胞增多,Transwe

9、ll結(jié)果可見下調(diào)miR-9組穿過小室細(xì)胞數(shù)量明顯減少,條件培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,成管能力顯著減弱;3.外源轉(zhuǎn)染miR-9 mimic可顯著提高HUVEC細(xì)胞miR-9的表達(dá)水平,Transwell結(jié)果顯示過表達(dá)miR-9組較多細(xì)胞穿至小室膜下,過表達(dá)miR-9 HUVEC細(xì)胞成管數(shù)量相比NC組顯著增多;且miR-9組內(nèi)皮細(xì)胞粘附力增強(qiáng);4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示,THBS2、COL18A1、PTCH1和PHD3可能為潛在miR-9的下游

10、靶基因,從而影響膠質(zhì)瘤增殖能力、遷移和侵襲、血管生成等生物學(xué)行為;5.qRT-PCR、Western blot、ELISA和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)THBS2、COL18A1、PTCH1和PHD3確實(shí)為miR-9直接調(diào)控的下游靶基因;6、膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中過表達(dá)C-MYC后,qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)miR-9表達(dá)增高;在U251細(xì)胞中應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)C-MYC后,miR-9表達(dá)下調(diào),且均主要影響miR-9-2的表達(dá);7、在膠

11、質(zhì)瘤細(xì)胞A172中瞬時(shí)上調(diào)OCT4的表達(dá),qRT-PCR結(jié)果顯示miR-9表達(dá)上調(diào),而且siRNA干擾U251細(xì)胞中OCT4的表達(dá),miR-9表達(dá)下調(diào),但是主要調(diào)節(jié)miR-9-1/3的表達(dá);8.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中過表達(dá)組蛋白去甲基化酶KDM6A/B,qRT-PCR結(jié)果顯示miR-9的表達(dá)增高,而在U251中干擾KDM6A/B表達(dá)則miR-9表達(dá)呈現(xiàn)降低,均主要調(diào)節(jié)miR-9-2的表達(dá)。
　　【結(jié)論】
　　1.MiR-9在