EGFRRVⅢ在惡性多形性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能.pdf

1、前言：
　　 EGFRvⅢ蛋白是EGFR蛋白最為常見(jiàn)的一種變構(gòu)形式,其在多種腫瘤組織中尤其是人腦惡性膠質(zhì)瘤組織中有所表達(dá),但在人體正常組織中卻無(wú)表達(dá)。EGFRvⅢ這種變構(gòu)蛋白是由正常EGFR基因中的第1與第8外顯子直接接合,在連接處形成新的甘氨酸而形成。正常EGFR基因的第2-7外顯子缺失使得正常EGFR蛋白的細(xì)胞外功能域部分的267個(gè)氨基酸缺失而形成EGFRvⅢ蛋白。這種變構(gòu)的EGFR蛋白在腫瘤組織中不需與EGFR相應(yīng)配體相結(jié)

2、合就能夠被持續(xù)的激活,進(jìn)而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展。一方面,EGFRvⅢ蛋白只在腫瘤組織中表達(dá)而不存在于正常組織中;另一方面,產(chǎn)生EGFRvⅢ蛋白的細(xì)胞,其在增殖、侵襲及血管發(fā)生等方面均表現(xiàn)出了各種調(diào)節(jié)失控進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因此,EGFRvⅢ蛋白是腫瘤的免疫治療中是備受關(guān)注的抗原靶點(diǎn)之一。在人多形性惡性膠質(zhì)瘤中,EGFRvⅢ蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲,其這種促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)

3、及白介素10(IL-10)的表達(dá)有關(guān)。
　　 材料與方法：
　　 1、腫瘤樣本的收集所有GBM腫瘤患者樣本均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科提供,經(jīng)患者知情同意后,手術(shù)中獲取。所有腫瘤樣本均病理診斷為Ⅳ級(jí)惡性膠質(zhì)瘤。腫瘤樣本獲取后,存放于-80℃深低溫冰箱里,備用。
　　 2、總RNA的提取及RF-PCR使用Takara RNAiso Reagent試劑按照說(shuō)明書(shū),提取腫瘤樣本總RNA。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè),OD2

4、60/OD280≥1.8并且經(jīng)瓊脂糖電泳無(wú)明顯降解的RNA樣本,用于RT-PCR及realtime RT-PCR實(shí)驗(yàn)。提取總RNA500ng,使用TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。EGFRvⅢ特異性引物:5'-GCGAGTCGGGCTCTGGA-3'/5'-TTCACCAATACCTATTCCGTTACAC-3'。樣本變性94℃2分鐘,PCR擴(kuò)增94℃30秒,55℃30秒,72℃1分鐘;30個(gè)循

5、環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物,包括171bp(EGFRvⅢ)和972bp(WT-EGFR),于2％瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。
　　 3、免疫組化
　　 標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,5um切片。切片常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù)。Hydrogen Peroxide Block中孵育30min。滴加適當(dāng)濃度鼠抗人單克隆抗體DH8.3,4℃過(guò)夜,滴加酶標(biāo)二抗,DAB顯色。
　　 4、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人惡性膠質(zhì)

6、瘤細(xì)胞系U87.MG培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中;穩(wěn)定表達(dá)EGFRvⅢ的細(xì)胞系U87.MGEGFRvⅢ由W.Cavenee and F.Fumari教授友情饋贈(zèng),培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素+200μg/mL G418培養(yǎng)基中,二種細(xì)胞系均置于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 5、M

7、TT分析對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的U87.MG和U87.MG.EGFRvⅢ細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,于37℃,5％CO2過(guò)夜培養(yǎng)。分別培養(yǎng)1、2、3、5、7天進(jìn)行MTT檢測(cè),每2天更換一次培養(yǎng)基。終止培養(yǎng),每孔加入DMSO溶液150ul,室溫下震蕩10min,選擇490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)。
　　 6、侵襲力實(shí)驗(yàn)分析基質(zhì)膠溶解,適當(dāng)濃度包被transwell板中,5000個(gè)U87.MG和U87.MG.EGFR

8、vⅢ細(xì)胞接種于上室1％血清培養(yǎng)基中,下室加入20％血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)48小時(shí)后,固定染色并計(jì)數(shù)。
　　 7、Realtime RT-PCR檢測(cè)將獲得的總RNA,使用SYBR PrimeScript RT-PCR Two-Step kit試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行realtime RT-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件95℃10秒;95℃5秒,60℃20秒,40個(gè)循環(huán)。IL-10特異性引物:5'-GAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGA

9、-3'/5'-AGGCTTGGCAACCCAGGTAAC-3'。TGF-β2特異性引物:5'-GCTTTGGATGCGGCCTATTG-3'/5'-CCAGCACAGAAGTTGGCATTGTA-3'。反應(yīng)結(jié)束后分析Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線,用Comparative Delta-deltaCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 8、Western blot鑒定使用能夠同時(shí)識(shí)別EGFR蛋白與EGFRvⅢ蛋白的EGFR

10、抗體進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)以鑒定細(xì)胞系U87.MG.EGFRvⅢ中EGFRvⅢ的穩(wěn)定表達(dá)。細(xì)胞樣本的蛋白提取,蛋白樣本的制備,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,雜交,顯色。
　　 結(jié)果：
　　 共收集GBM腫瘤樣本26例,經(jīng)過(guò)RT-PCR篩選,EGFRvⅢ陽(yáng)性表達(dá)樣本5例,占總GBM患者的19.2％。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。腫瘤樣本進(jìn)一步經(jīng)過(guò)免疫組化鑒定證實(shí)存在EGFRvⅢ陽(yáng)性表達(dá)。使用rea

11、ltime RT-PCR的方法檢測(cè)TGF-β2與IL-10在兩組腫瘤樣本中的表達(dá)水平顯示;TGF-β2在兩組腫瘤樣本中,mRNA水平的表達(dá)量存在明顯差異,EGFRvⅢ陽(yáng)性組腫瘤樣本其TGF-β2表達(dá)量明顯高于EGFRvⅢ陰性組。而IL-10的表達(dá)量?jī)山M間無(wú)明顯差異。對(duì)U87.MGEGFRvⅢ細(xì)胞系使用westernblot鑒定結(jié)果顯示,細(xì)胞系U87.MGEGFRvⅢ能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFRvⅢ基因。MTT檢測(cè)U87.MG與U87.MGEGF

12、RvⅢ兩種細(xì)胞系增殖能力結(jié)果顯示,U87.MG.EGFRvⅢ細(xì)胞系具有明顯的增殖優(yōu)勢(shì)。侵襲力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,U87.MG與U87.MGEGFRvⅢ兩種細(xì)胞系兩組細(xì)胞系間存在明顯的侵襲力差異,U87.MG.EGFRvⅢ其侵襲性明顯高于U87.MG細(xì)胞系且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EGFRvⅢ基因能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力。Real-time RT-PCR分別檢測(cè)TGF-β2與IL-10在兩組細(xì)胞系中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示U87.MG.EGFRv

13、Ⅲ細(xì)胞系中其TGF-β2及IL-10的表達(dá)量均明顯高于U87.MG細(xì)胞系中的表達(dá)量,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們觀察到了EGFRvⅢ基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖與侵襲的影響,進(jìn)一步我們檢測(cè)了免疫抑制因子TGF-β2與IL-10的上調(diào)表達(dá)與EGFRvⅢ表達(dá)之間的關(guān)系,TGF-β2對(duì)人體的免疫監(jiān)控,獲得性免疫及自然免疫均具有明顯影響。據(jù)此,我們得出結(jié)論1,EGFRvⅢ能夠明顯增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力及侵襲性;