5-Aza-CdR對Hs888T骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及APAF-1基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤,好發(fā)于青少年,惡性程度高,進(jìn)展迅速,然而骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制尚未清楚。表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默是腫瘤中常見的基因變異。APAF-1基因位于染色體12q23,是在線粒體凋亡途徑中p53下游的關(guān)鍵成分,是凋亡的核心。在多種腫瘤和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了APAF-1基因甲基化。我們前期實(shí)驗(yàn)用COBRA方法檢測證實(shí)Hs888T細(xì)胞系中APAF-1基因存在甲基化。本實(shí)驗(yàn)擬檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制

2、劑5-氮雜-2'脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理前后骨肉瘤細(xì)胞Hs888T的細(xì)胞增殖、周期及Apaf-1蛋白表達(dá)水平變化,探討5-Aza-CdR在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的作用及機(jī)制。
　　 方 法
　　 1、主要試劑
　　 骨肉瘤細(xì)胞系Hs888T。購自上海細(xì)胞庫,5-Aza-CdR購自Sigma公司,DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司,羊抗人 APAF-1多克隆抗體及兔抗羊二抗購自SantaCruz公司。

3、　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理
　　 人骨肉瘤細(xì)胞系Hs888T接種于DMEM培養(yǎng)液于37℃,含5％CO2的濕潤的空氣培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24小時(shí)候后用不同濃度的5-Aza-CdR(0、0.1 and 0.3mmol/L)處理48h、96h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 3、四唑鹽(MTT)比色法檢測Hs888T增殖活性
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按1 x103/100μl細(xì)胞接種于96孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液200μL。

4、實(shí)驗(yàn)組和對照組分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)44h、92h后傾去培養(yǎng)基,各孔加入5g/L,的MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。選擇570nm波長,在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(A)。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡水平
　　 收集處理的各組細(xì)胞,70％冰乙醇4℃固定過夜,RNaseA 37℃孵育30min后,加入0.05g/L碘化丙啶(PI)1ml,4℃避光染色30min后上機(jī)檢測,測定細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率。
　　

5、 5、Western blot法檢測細(xì)胞Apaf-1蛋白表達(dá)水平
　　 提取總蛋白,用考馬斯亮蘭法定量。將等量的總蛋白(100μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF上,用5％脫脂奶粉液室溫下封閉2h。加一抗4℃過夜,TTBS液洗膜兩次后加入二抗37℃孵育1h。膜經(jīng)ECL發(fā)光試劑處理后檢測蛋白表達(dá)情況。
　　 6、統(tǒng)計(jì)分析
　　 資料比較采用t檢驗(yàn),利用SPSS for Window 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

6、。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié) 果
　　 本實(shí)驗(yàn)用5-Aza-CdR處理Hs888T細(xì)胞后,MTT檢測發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR使Hs888T細(xì)胞增殖受到不同程度抑制,通過流式細(xì)胞術(shù)碘化丙啶PI單染結(jié)果我們可以看出5-Aza-CdR阻滯Hs888T細(xì)胞在G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且呈時(shí)間和濃度依賴性。Western blot結(jié)果示Hs888T細(xì)胞系經(jīng)5-Aza-CdR處理后隨著藥物濃度的增加APAF-1蛋白的表達(dá)逐漸