RNAi抑制MDM2基因表達(dá)對人骨肉瘤U-20S細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、10 4 5 92 0 0 5 0 4 9公 開文學(xué) 論 大 位 州 學(xué) 鄭 士碩(科 學(xué) 學(xué)位 )R N A i抑 制 M D N 泣 基 因表達(dá)對 人骨 肉瘤U 一05 細(xì) 胞 增 殖 和 凋 亡 的影 響院 系 名 稱 : 基礎(chǔ) 醫(yī)學(xué) 院學(xué) 科 門 類 : 醫(yī) 學(xué)專 業(yè) 名 稱 : 病 理 學(xué) 與病 理 生理 學(xué)作 者 姓 名 : 鄧 祖 麗雅導(dǎo) 師姓 名 、職稱 : 趙 國強(qiáng) 教授趙 明耀 教 授二 零 零 九 年 十 一 月鄭

2、州大學(xué) 2009 屆碩十研究生學(xué) 位論文 ， 卜 文摘 要響 。實驗方 法利 用 Prom eg a 和 A mb ion 的 si RN A 靶 序 列 分 析 設(shè) 計 軟 件 ， 分 析 人 M D M ZcD N A 編碼 序 列 ( N M es oo239 2)， 依 據(jù) si RN A 靶 序 列 設(shè)計 原 則， 應(yīng) 用B L A ST 同源 性 分析 ， 確 定si R N A 靶 序 列 。合 成 3 對 M D M Z

3、 基 因靶 向 si R N A 序 列 的D N A 單鏈 ，退 火 成雙鏈 o N A ，用B am H I 和 H i ndlll 雙 酶 切psi l eneerZ. l 制 備 線 形雙 粘si R N A載體 ; 將退火 的發(fā)卡樣si RN A 片段重組入psil encer 2 . 1; 利用B am H I 和Hi ndln 雙酶 切 篩 選 得 到 重 組 子 psi l eneer Z .l一 M n M Zsi 3

4、73 、 psi l eneer Z . l一 M n M Zsi 646 和Ps il e ncer2.1一 M D M Zsi 9 46 ; 對 重 組 子 的插 入 序 列 進(jìn) 行 D N A 序 列 測 定 ，并 與 設(shè) 計序 列 做 同源 性 比較 。 將 psi l eneer z .l一 M o 碰 51 373 、psi 一 eneer z . l一 M D M Zsi “ 6 和Ps il encer2.1一 M D

5、M Zsi 9 46 轉(zhuǎn) 入人骨 肉瘤u 一 20 5 細(xì) 胞 中 ， 同時設(shè)空載 體對 照 組 (轉(zhuǎn)染 空載 體psil encer Z . l) 和 空 白對 照 組 (未轉(zhuǎn) 染 人骨 肉瘤 U 一 20 5 細(xì) 胞 ) ; R T 一 P C R和 W est em 一 Blot 方法檢 測 各 組細(xì)胞M D M Zm R N A 和 蛋 白表達(dá)水 平 ; 流式細(xì) 胞 術(shù)和M 竹 法 檢 測 各 組 細(xì) 胞 的細(xì) 胞 生長和 凋

6、亡 情 況 。實驗 結(jié) 果1. 初 步篩選 出58 個 候 選 si R N A 靶 區(qū)段 ， 候選 序 列 又 經(jīng)過 進(jìn) 一步 的 同源序 列 檢 索和優(yōu) 選 ， 最 后確 定 (N M002392 ) 373一 39 1 位 (C A A G A G A C C CU G G U U A G A C ) 、64 6一 664 位 (U C A U C G G A C U C A G G U A C A U ) 和 946一 964

7、位 (U C U A C A G G G A C GC C A U C G A ) 為靶 序 列 。2. B 田 嘰 H l 和 H i ndlll 雙 酶 切 篩 選 得 到 重 組 子 psi l eneer Z . l一 M D MZ si 373 、p si l enCerZ.l一 M n M Zsi 646 和psi l eneer z .l一 M n M Zsi 946 ，測 序 分析 其插 入序 列 與 設(shè)計完全 一致 。

8、3. 實驗 z、 2 、 3 組 (轉(zhuǎn)染p si l enc時 .1一 M n M Zsi 373 、 轉(zhuǎn) 染p si l eneer z . l 一 M n M Zsi “ 6 、轉(zhuǎn) 染 p si l eneer z .l一 M n M Zsi 946 ) 細(xì) 胞 M D M Z m 洲 ^ 的 相 對 表 達(dá) 量 分 別 為0.12士 0. 02 、 0. 2 1土 0. 03 、 0. 27士 0. 03 ; 空載 體 對 照 組

9、 和 空 白對 照 組 細(xì) 胞 M D M Zm R N A的相 對 表 達(dá) 量 分 別 為 0.78士 0 .11 和 0 . 82士 0.13 。 實驗 1、 2 、 3 組 細(xì) 胞 M D M Zm R N A 的相 對 表 達(dá) 量 與 2 個 對 照 組 相 比 ，M D M Zm R N A 的相 對 表 達(dá) 量 顯 著 降低 ，統(tǒng) 計 學(xué)分 析 差 異 有 顯 著 性 (P <0 . 05 )。4. 在 約 為gokD