5-Aza-CdR對胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CDH8基因的表達(dá)影響及聯(lián)合吉西他濱對細(xì)胞的增殖影響體外研究.pdf

1、胰腺癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，以惡性程度高，進(jìn)展迅速、手術(shù)切除率低和預(yù)后差為特點(diǎn)。近年來其發(fā)病率在國內(nèi)外呈上升趨勢。外科手術(shù)切除是目前治療胰腺癌的最有效手段，但由于胰腺癌缺乏特異性臨床表現(xiàn)、癥狀出現(xiàn)晚和侵襲轉(zhuǎn)移性高，早期診斷困難，確診時80％的患者已屬晚期，因此僅有很小一部分確診病例可以通過手術(shù)切除。盡管胰腺癌的化療、放療和手術(shù)治療等方面都取得了進(jìn)步，但其5年生存率仍低于5%。近幾十年分子生物學(xué)的發(fā)展、人類基因組計劃完成和癌癥生物學(xué)

2、的新發(fā)現(xiàn)使得基因治療成為胰腺癌一個新的希望。因此，探尋基因治療的有效方法以提高胰腺癌多學(xué)科綜合治療效果顯得十分必要。
　　表觀遺傳學(xué)是指在沒有DNA序列變化的基礎(chǔ)上基因表達(dá)及基因功能的誘導(dǎo)和維持發(fā)生可遺傳性變化。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要修飾方式之一，與基因表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印記、女性 X染色體失活和細(xì)胞分化及增生等方面密切相關(guān)。近年大量研究發(fā)現(xiàn)，DNA的甲基化引起的表觀遺傳沉默在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的作用。

3、研究表明PCDH8基因是一個新型的候選抑癌基因，在某些腫瘤發(fā)生突變或表觀遺傳沉默參與腫瘤的發(fā)生，而這種基因表觀遺傳沉默可通過去甲基化恢復(fù)基因表達(dá)。
　　基于以上研究理論，本實(shí)驗(yàn)初步檢測出PCDH8基因在胰腺癌細(xì)胞株Capan-2發(fā)生異常甲基化，進(jìn)一步使PCDH8基因去甲基化，恢復(fù)其抑癌作用，并聯(lián)合抗腫瘤藥充分發(fā)揮抗腫瘤作用，為臨床上胰腺癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　了解甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷

4、（5-Aza-CdR）胰腺癌細(xì)胞株Capan-2原鈣黏蛋白8（protocadherin8，PCDH8）基因DNA啟動子甲基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞生長抑制與凋亡的影響。
　　方法：
　　1.采用MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）檢測不同濃度5-Aza-CdR分別處理胰腺癌Capan-2細(xì)胞24h、48h、72h后腫瘤細(xì)胞的生長影響，以及聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌Capan-2細(xì)胞生長影響。
　　2

5、.利用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測經(jīng)5-Aza-CdR以及聯(lián)合吉西他濱處理胰腺癌Capan-2細(xì)胞后凋亡情況。
　　3.通過甲基化特異性PCR（MSP）、RT-PCR、Western Blot技術(shù)分別檢測經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR處理前和處理后的胰腺癌Capan-2細(xì)胞PCDH8基因的甲基化狀態(tài)、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的5-Aza-CdR均能使胰腺癌細(xì)胞（Capan-

6、2）增長速度減慢，呈濃度依賴性，也呈一定的時間負(fù)相關(guān)。5-Aza-CdR聯(lián)合吉西他濱可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞生長。
　　2.5-Aza-CdR和吉西他濱都能誘導(dǎo)胰腺癌（Capan-2）細(xì)胞發(fā)生凋亡，而兩者聯(lián)合可顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
　　3.不同濃度的5-Aza-CdR可逆轉(zhuǎn)PCDH8基因在胰腺癌細(xì)胞（Capan-2）的甲基化狀態(tài)，使其發(fā)生去甲基化，恢復(fù) mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，并呈一定的濃度正相關(guān)。
　　結(jié)論：

7、r>　　1.5-Aza-CdR可抑制胰腺癌Capan-2細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并與吉西他濱有協(xié)同抗腫瘤作用。
　　2.5-Aza-CdR可有效逆轉(zhuǎn)PCDH8基因在胰腺癌細(xì)胞株（Capan-2）的高甲基化狀態(tài)，解除DNA高甲基化導(dǎo)致的基因沉默，重新誘導(dǎo)基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。
　　3.5-Aza-CdR對胰腺癌Capan-2細(xì)胞的抑制作用和聯(lián)合吉西他濱的抗腫瘤作用可能與PCDH8基因去甲基化后表達(dá)恢復(fù)，發(fā)揮抑癌功能相關(guān)。