Jagged1介導的Notch信號通路激活誘導大鼠肝移植術后膽管上皮-間質轉變的研究.pdf

1、目的：探討Jagged 1/Notch 信號通路誘導的上皮-間質轉變在大鼠肝移植術后損傷膽管上皮細胞中的作用研究。
　　 方法：1）96只清潔級、雄性健康SD 大鼠隨機分成3組，A組；肝移植組（48只），B組；假手術組（24只，開腹肝臟游離，不損傷血管和膽管）和C組；正常對照組（24只）。采用改良Kamada 原位“二袖套”法建立大鼠肝移植模型，大鼠隨機分成受體組和供體組，受體體重略大于供體體重，供、受體肝動脈結扎，不吻合。分別

2、于術后1d、7d、14d和28d 采集靜脈血檢測總膽紅素（TBIL）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）、谷丙轉氨酶（ALT），同一時間點處死大鼠取肝組織，蘇木素-伊紅染色（HE）觀察三組大鼠肝臟病理學改變，免疫組織化學定位和免疫印跡（western-blot）法檢測肝組織Notch 信號配體Jagged1、靶基因Hes1，間質細胞標記成纖維細胞特異性蛋白-1（FSP-1）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和膽管

3、細胞特異性標記角蛋白19片段（CK19）的表達。2）體外分離培養(yǎng)SD 大鼠原代肝內(nèi)膽管上皮細胞(rIBECs)，錐蟲藍拒染檢測活性、免疫細胞化學（CK19）鑒定細胞。構建pEGFPIRES2-Jagged 1 真核表達載體并Lipofectamine TM2000 轉染原代肝內(nèi)膽管上皮細胞，設轉染組、轉染+Notch 信號抑制劑DAPT 處理組(劑量為：1μmol/L)、空載體組、未處理組。western-blot 法檢測四組細胞Jag

4、ged 1 蛋白、Hes1 蛋白，間質細胞標記蛋白（FSP-1，vimentin，α-SMA）和CK19 蛋白的表達。倒置顯微鏡觀察四組膽管細胞的形態(tài)，transwell 小室法檢測四組細胞的遷移侵襲能力。
　　 結果：
　　 1)成功建立大鼠原位肝移植模型，受體大鼠術后正常條件下喂養(yǎng)存活良好。術后肝功能檢測，肝移植組大鼠淤膽明顯，TBIL(32.05±3.28μmol/L),γ-GT(118.3±17.4μmol/L)

5、升高顯著，尤以術后14d 升高明顯，術后28d出現(xiàn)下降。蘇木素-伊紅染色（HE）顯示肝移植組術后門脈匯管區(qū)損傷膽管呈明顯的小膽管反應改變；膽管擴張、膽管細胞增生、膽管細胞數(shù)量增多、纖維組織增生、門脈匯管區(qū)炎性細胞浸潤。免疫組化檢測：肝移植組術后增生膽管細胞的胞膜及胞漿陽性表達Jagged 1，Hes1，呈棕黃顆粒，且隨術后時間延長，棕黃色顆粒顏色加深，對照組Jagged 1，Hes1 弱表達于正常膽管，同時弱表達門脈匯管區(qū)、肝細胞胞膜以

6、及肝靜脈內(nèi)皮細胞。肝移植組間質細胞標記FSP-1,vimentin，α-SMA 均陽性表達于增生顯著的膽管細胞，呈棕黃色顆粒，且隨術后時間延長，棕黃色顆粒顏色加深，同時增生膽管細胞陰性表達CK19。Western-blot 檢測：對照組肝組織Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白低表達，間質細胞標記蛋白（FSP-1，vimentin，α-SMA）低表達，CK19 蛋白高表達。術后7d 肝移植組Jagged 1，Hes1，F(xiàn)SP-1，vi

7、mentin，α-SMA 均出現(xiàn)高表達，且隨術后時間延長，表達逐漸增強，CK19 蛋白表達明顯減弱。
　　 2)轉染Jagged 1 載體大鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白高表達，伴隨間質標記蛋白（FSP-1,vimentin，α-SMA）高表達，CK19 蛋白低表達，DAPT 處理組、空載組和未處理組Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白低表達，且間質細胞標記蛋白（FSP-1，vimentin,α-SM

8、A）低表達，而CK19 蛋白高表達。轉染組細胞的形態(tài)呈梭形樣改變，其余三組細胞為鵝卵石樣細胞形態(tài)。transwell 小室檢測細胞遷移侵襲能力發(fā)現(xiàn)，轉染組遷移細胞(21333±520)與其余三組遷移細胞(2083±381，2000±661,1833±389)差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結論：改良Kamada 原位“二袖套”大鼠肝移植術后早期（≤4w），損傷膽管呈小膽管反應改變，該過程中Jagged 1 激活的Notch 信號