HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后外周免疫細(xì)胞及骨髓造血干祖細(xì)胞HBV存在狀態(tài)檢測及臨床意義分析.pdf

1、肝移植(liver transplantation，LT)是目前治療終末期肝病(end stageliver disease，ESID)的有效手段。在我國，乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)相關(guān)肝病已成為肝移植的主要適應(yīng)癥。但是肝移植術(shù)后，即使在使用拉米夫定(Lamivudine，LAM)和乙肝免疫球蛋白的情況下，仍有較高的HBV再感染率和乙肝(hepatitis B，HB)復(fù)發(fā)率，嚴(yán)重影響了肝移植的中遠(yuǎn)期效果。本課

2、題從研究乙肝病毒相關(guān)肝病肝移植術(shù)后的免疫．造血系統(tǒng)乙肝病毒庫入手，揭示肝移植術(shù)后HBV再感染/HB復(fù)發(fā)的可能機(jī)制。 在第一部分，我們建立了一種靈敏可靠的檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，為后繼的研究打下了基礎(chǔ)。在第二部分，我們利用密度梯度離心和免疫磁珠分離法獲得骨髓造血干祖細(xì)胞和外周血單個核細(xì)胞(peripheral blo

3、od mononuclear cell，PBMC)、T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞(monocyte，MNC)，分別檢測總：HBV DNA和HBV cccDNA，證實了細(xì)胞內(nèi)仍存在HBV，但未發(fā)現(xiàn)有復(fù)制的證據(jù)。在第三部分，我們利用特異性的HBV-Alu-PCR方法檢測PBMC和骨髓造血干祖細(xì)胞內(nèi)HBV X基因的整合情況，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞內(nèi)無HBV X基因的整合，證實HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后的外周免疫細(xì)胞和骨髓造血干祖細(xì)胞不是HBV整合的適宜場

4、所。 第一部分：酶輔助Taq man探針法實時熒光定量PCR檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA方法的建立 目的：建立靈敏可靠的實時熒光定量PCR方法，進(jìn)行HBV cccDNA的檢測。 方法：利用HBV松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)和cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異，參考現(xiàn)有文獻(xiàn)，合成兩對針對HBV cccDNA的引物，在有或者無綠豆核酸酶(Mung Bean Nuclease，MBN)輔

5、助的情況下，利用不同濃度的從Dane顆粒中提取的HBV rcDNA和含HBV adr<,4>亞型全基因組的pBHB4質(zhì)粒為模板，通過預(yù)實驗選擇最佳引物并確定MBN的最適用量，建立用于檢測HBV cccDNA的酶輔助實時熒光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-FQ PCR)方法。 結(jié)果：1．兩對引物均可擴(kuò)增cccDNA，也可擴(kuò)增較高濃度的HBV rcDNA，即對HBV c

6、ccDNA的擴(kuò)增僅具有相對特異性；2．MBN可特異性降解HBV rcDNA的單鏈部分，提高HBV cccDNA引物的特異性，其最適用量為5．0IU；3．跨越HBV rcDNA雙鏈上兩個缺口的引物對HBVcccDNA的特異性高于僅跨越一個缺口的引物；4．在MBN輔助下，利用跨越HBVmDNA雙鏈兩個缺口的引物，建立了檢測HBV cccDNA的Taq man探針RT-FQ PCR方法，其檢測限為5．00x10<'2>～5.00×10<'8>

7、copies/ml。 結(jié)論：用于HBV cccDNA檢測的酶輔助RT-FQ PCR方法成功建立，靈敏度高，特異性好，能滿足研究的需要。 第二部分：HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后外周免疫細(xì)胞與骨髓CD34+細(xì)胞總HBV DNA及HBV cccDNA檢測與臨床意義分析 目的：了解HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后，在持續(xù)規(guī)范拉米夫定聯(lián)合乙肝免疫球蛋白抗病毒治療下，外周免疫細(xì)胞與骨髓造血干祖細(xì)胞內(nèi)HBV含量及其復(fù)制狀態(tài)，分析其

8、臨床意義。 方法：25例肝移植受體(男22，女3)術(shù)后均應(yīng)用拉米夫定聯(lián)合小劑量乙肝免疫球蛋白抗病毒治療。單用FK<,506>抗排異者12例，單用CsA抗排異者13例。平均術(shù)后時間為33.32±14.81月(11～77月)，平均年齡為45.88±8.71歲(36～64歲)。術(shù)前非活躍復(fù)制者7例；HBV活躍復(fù)制者18例，其血清HBV DNA平均滴度為10<'5.954±1.457>copies/ml(5.23×10<'3>～8.26

9、×10<'7>copies/ml)。采集25例HBV相關(guān)肝病肝移植受體的外周靜脈血及其中23例的骨髓血，以密度梯度離心結(jié)合單克隆免疫磁珠分離法獲取單個核細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓造血干祖細(xì)胞(CD<,34><'+>細(xì)胞)，提取細(xì)胞內(nèi)DNA，以實時熒光定量PCR分別檢測各種細(xì)胞內(nèi)總HBVDNA和HBV cccDNA。同時采集血樣檢測血清HBV DNA定量、乙肝表面抗體濃度、乙肝標(biāo)志物、血藥濃度。 結(jié)果：25例Anti-H

10、Bs均為陽性，平均全血表面抗體濃度為119.14±90.7砌幾；所有受體的血清HBV抗原成分均為陰性；Anti-HBe和Anti-HBc都陽性者5例，Anci-HBe和Anti-HBc都陰性者6例；Anti-HBe陽性而Anlti-HBc陰性者1例；Anti-HBe陰性而Anti-HBc陽性者13例。所有受體血清HBV DNA陰性。25例受體的PBMC、MNC(第9和第17例除外)、B(第8例除外)、T、CD<,34><'+>細(xì)胞內(nèi)總H

11、BV DNA均呈陽性，平均濃度分別為10<'3.3263±0..6956>、10<'2.9425±0.6462>、10<'2.7213±0.6223>、10<'2.9522±0.9319<和10<'3.3373±0.6583>copies/10<'6>cells。方差分析表明不同細(xì)胞內(nèi)HBV DAN含量有差異(F=3.302，P=0.013)，多因素分析表明主要的外周免疫細(xì)胞T細(xì)胞、B細(xì)胞和MNC內(nèi)的：HBV DNA含量與不完全相同的因

12、素相關(guān)。所有細(xì)胞內(nèi)及血清內(nèi)均未檢測到HBV cccDNA。 結(jié)論：HBV相關(guān)肝病肝移植術(shù)后，即使在較長的術(shù)后時間以及規(guī)范的抗病毒治療之下，外周免疫細(xì)胞及骨髓造血干祖細(xì)胞(CD<,34><'+>細(xì)胞)內(nèi)均有H-BV DNA低濃度存在，且受不全相同的因素影響。雖然未檢測到細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA，但外周免疫細(xì)胞與骨髓造血干祖細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA均持續(xù)陽性，不能排除外周免疫細(xì)胞和骨髓造血干祖細(xì)胞仍存在極低水平的HBV復(fù)制。在此情況

13、下，不主張中止術(shù)后的抗病毒治療。免疫細(xì)胞內(nèi)HBV含量與免疫功能的關(guān)系也待深入研究。 第三部分：利用HBV-Alu-PCR檢測HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后外周血單個核細(xì)胞與骨髓造血干祖細(xì)胞(CD34+)HBVX基因整合狀態(tài) 目的：了解HBV X基因在HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后外周免疫細(xì)胞和骨髓CD<,34><'+>細(xì)胞內(nèi)的整合情況及其對PBMC內(nèi)HBV長期維持陽性的意義。 方法：病例選擇及其基本臨床資料同第二部分

14、。獲得其PBMC及骨髓CD<,34><'+>細(xì)胞后，提取細(xì)胞DNA。因x基因的整合頻率最高，設(shè)計HBV x基因的特異引物，利用HBV-Alu-PCR方法進(jìn)行三輪半巢式PCR，終產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收、連接載體、篩選擴(kuò)增后測序，檢測有無X基因整合。 結(jié)果：經(jīng)PCR后電泳及測序分析，25例HBv相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后的PBMC內(nèi)未檢測出HBV X基因的整合，其中采集到骨髓標(biāo)本的23例CD<,34><'+>細(xì)胞中亦未檢測到HBV X基因的