Galectin-9-Tim-3信號對NK細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是一種嗜肝性病毒，HBV感染會引起肝臟的一系列炎癥，包括肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至引起肝癌的發(fā)生。HBV感染易形成慢性感染而難以治愈，與肝臟微環(huán)境易引起機(jī)體的免疫耐受密切相關(guān)。HBV感染早期，固有免疫細(xì)胞尤其是NK細(xì)胞是清除HBV病毒的主要效應(yīng)細(xì)胞。NK細(xì)胞表面表達(dá)多種協(xié)同共刺激性分子（如CD28）和共抑制性分子（如PD-1、2B4等）。HBV慢性感染后，NK細(xì)胞表

2、面共抑制性分子表達(dá)升高，使其功能受損進(jìn)而引起機(jī)體免疫耐受不利于病毒的清除。已有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HBV質(zhì)粒的NK92細(xì)胞或者從HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝臟分離的NK細(xì)胞表面共抑制分子Tim-3表達(dá)升高，阻斷Tim-3/Galectin-9通路后顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷和IFN-γ產(chǎn)生的能力。因此，HBV慢性感染過程中Galectin-9/Tim-3信號與NK細(xì)胞功能受損密切相關(guān)。本研究首先探討了肝細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)對NK細(xì)胞功能的影響。

3、在比較四種不同肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2-N1以及HBV陽性的HepG2-HBV和HepG2.2.15細(xì)胞表面Galectin-9表達(dá)差異的基礎(chǔ)上，觀察NK細(xì)胞對不同Ga-lectin-9表達(dá)水平的靶細(xì)胞的殺傷效率和產(chǎn)生IFN-γ能力的變化，并觀察Galectin-9對NK細(xì)胞凋亡的影響。另一方面，由于有研究報道Tim-3是NK細(xì)胞的共受體，因此，我們進(jìn)一步探討了Galectin-9/Tim-3信號通路的強(qiáng)弱不同是否對NK細(xì)胞功能

4、產(chǎn)生不同的影響。一方面，在靶細(xì)胞上過表達(dá)不同水平的Galectin-9，或者利用不同濃度的重組Galectin-9蛋白刺激NK細(xì)胞;另一方面利用不同濃度的a-lactose孵育靶細(xì)胞，阻斷Galectin-9-Tim-3的結(jié)合，從這兩方面不同程度地改變Galectin-9/Tim-3信號的強(qiáng)度，觀察NK細(xì)胞功能的變化。
　　第一部分HBV通過上調(diào)肝細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)抑制NK細(xì)胞的功能
　　方法
　　1.

5、以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15細(xì)胞、HBV陽性的C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞以及臨床HBV陽性肝癌患者的肝組織為研究對象，利用RT-PCR和FACS技術(shù)，檢測Galectin-9的表達(dá)。
　　2.與HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15細(xì)胞共孵育后，MTT法檢測NK細(xì)胞對其殺傷效率的變化;FACS法檢測NK細(xì)胞CD107a和IFN-γ的水平。
　　3.與HepG2和HepG2.2.15細(xì)

6、胞共孵育后，利用FACS技術(shù)檢測NK細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例。
　　4.用重組人Galectin-9蛋白(rh-Galectin-9)刺激NK細(xì)胞，再將其與靶細(xì)胞共孵育，MTT法檢測NK細(xì)胞殺傷效率的變化，AnnexinⅤ/PI雙染法觀察NK細(xì)胞的凋亡。
　　5.用α-乳糖（α-Lactose）孵育HepG2.2.1.5細(xì)胞以結(jié)合HepG2.2.1.5細(xì)胞表面的Galectin-9，阻斷Galectin-9/Tim-3信號，再將N

7、K細(xì)胞與之孵育，MTT法觀察NK細(xì)胞的殺傷效率，F(xiàn)ACS技術(shù)檢測IFN-γ的產(chǎn)生情況。
　　6.通過網(wǎng)站預(yù)測可能調(diào)節(jié)Galectin-9表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括GATA-2和GATA-3。予HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染GATA-2和GATA-3的shRNA分別沉默GATA-2和GATA-3后，Q-PCR和FACS技術(shù)檢測Galectin-9的表達(dá);HepG2細(xì)胞過表達(dá)GATA-2后，Q-PCR和FACS技術(shù)檢測Galectin-9的表達(dá)

8、。通過網(wǎng)站預(yù)測出可能調(diào)節(jié)Galectin-9表達(dá)的microRNA-22、microRNA-575以及microRNA-1275;HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染microRNA-22、microRNA-575以及microRNA-1275的模擬物和抑制物，F(xiàn)ACS法檢測細(xì)胞表面Galectin-9表達(dá)的變化。
　　結(jié)果
　　1.與HBV陰性的HepG2細(xì)胞相比，HBV陽性的HepG2-HBV和1HepG2.2.

9、15細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)顯著升高。與健康對照組相比，HBV陽性鼠以及HBV陽性肝癌患者肝細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)亦明顯升高。
　　2.與HBV陰性的HepG2細(xì)胞相比，與HBV陽性的HepG2-HBV和HepG2.2.15細(xì)胞共孵育后，NK細(xì)胞對其殺傷效率明顯降低，而且CD107a和IFN-γ的表達(dá)水平降低。
　　3.與HepG2細(xì)胞相比，與HBV陽性的HepG2.2.15共孵育后，NK細(xì)胞發(fā)生凋亡的

10、比例增加。
　　4.Galectin-9重組蛋白刺激過的NK細(xì)胞殺傷效率降低，發(fā)生凋亡的比例增加。5.a-Lactose孵育HepG2.2.15細(xì)胞阻斷Galectin-9/Tim-3信號通路后，NK細(xì)胞對其殺傷效率增強(qiáng)，IFN-γ的水平顯著增加。
　　6.HepG2.2.15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GATA-2和GATA-3的shRNA，成功沉默GATA-2和GATA-3后，Galectin-9表達(dá)明顯降低;HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GATA

11、-2的過表達(dá)載體過表達(dá)GATA-2后，細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)則明顯升高。
　　7.microRNA-22、microRNA-575以及microRNA-1275對Galectin-9的表達(dá)沒有調(diào)控作用。
　　結(jié)論
　　1.HBV陽性的肝細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)明顯高于HBV陰性的肝細(xì)胞。
　　2.Galectin-9通過與NK細(xì)胞表達(dá)的Tim-3的結(jié)合而抑制NK細(xì)胞的殺傷效率，減少IFN-γ

12、的產(chǎn)生，并促使其發(fā)生凋亡。
　　3.HBV可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和GATA-3的表達(dá)，GATA-2和GATA-3可能在轉(zhuǎn)錄水平上參與對Galectin-9表達(dá)的調(diào)控;microRNA-22、microRNA-575和microRNA-1275對Galectin-9的表達(dá)沒有調(diào)控作用。
　　第二部分Galectin-9-Tim-3信號的強(qiáng)弱對NK細(xì)胞功能的不同影響
　　方法
　　1.FACS法檢測不同腫瘤細(xì)胞表

13、面Galectin-9表達(dá)的差異。
　　2.與Galectin-9低、中、高表達(dá)的Raji、HL-60和Jurkat細(xì)胞共孵育后，MTT法檢測NK細(xì)胞殺傷效率的變化。
　　3.構(gòu)建Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至HepG2和HEK-293細(xì)胞中，RT-PCR和FACS法驗(yàn)證Galectin-9表達(dá)載體的過表達(dá)效果。
　　4.Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，再將NK細(xì)胞與之孵育，MTT法檢測

14、NK細(xì)胞殺傷效率的變化。
　　5.用不同濃度的Galectin-9重組蛋白（rh-Galectin-9）刺激NK細(xì)胞，再將其與靶細(xì)胞共孵育，MTT法檢測NK細(xì)胞殺傷效率的變化。FACS法檢測NK細(xì)胞CD107a的表達(dá)及IFN-γ的產(chǎn)生水平。
　　6.用不同濃度的α-乳糖(α-Lactose)孵育HCT-116和HL-60細(xì)胞結(jié)合其表面Galectin-9以達(dá)到不同程度地阻斷Galectin-9/Tim-3信號通路的目的，再將

15、NK細(xì)胞與之孵育，MTT法檢測NK細(xì)胞殺傷效率的變化。FACS法檢測NK細(xì)胞CD107a的表達(dá)及IFN-γ的產(chǎn)生水平。
　　7.與轉(zhuǎn)染不同濃度的Galectin-9表達(dá)質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)染不同時間的HepG2細(xì)胞共孵育后，MTT和CFSE/7-AAD法檢測NK細(xì)胞的殺傷效率，F(xiàn)ACS法檢測NK細(xì)胞CD107a和胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.通過FACS法檢測不同腫瘤細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)，將Raji

16、、HL-60和Jurkat細(xì)胞分別定義為Galectin-9低、中、高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
　　2.分別與Galectin-9低、中、高表達(dá)的Raji、HL-60和Jurkat細(xì)胞共孵育后，NK細(xì)胞對三種靶細(xì)胞的殺傷并沒有差異。
　　3.構(gòu)建Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至HepG2和HEK-293細(xì)胞中，RT-PCR和FACS法驗(yàn)證Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　4.轉(zhuǎn)染Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒后

17、，HEK-293細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)明顯增加，并且NK細(xì)胞對其殺傷效率明顯增強(qiáng)。
　　5.隨著rh-Galectin-9刺激濃度的增加，NK細(xì)胞對HepG2細(xì)胞的殺傷效率先增強(qiáng)后減弱。NKL細(xì)胞CD107a也呈現(xiàn)先增強(qiáng)而后有減弱的趨勢。
　　6.當(dāng)α-Lactose孵育濃度較小時，NK細(xì)胞對HCT-116和HL-60細(xì)胞的殺傷效率隨著α-Lactose濃度的增加而增強(qiáng);當(dāng)α-Lactose孵育濃度較大時，NK細(xì)

18、胞對HCT-116和HL-60細(xì)胞的殺傷效率減弱。
　　7.隨著Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度的增加，HepG2細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)逐漸增加，而NK細(xì)胞對其殺傷效率先增強(qiáng)后減弱;Galectin-9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時間從24h、48h到72h，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，HepG2細(xì)胞表面Galectin-9的表達(dá)先增加后減弱，其中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24h時，Galectin-9表達(dá)較低，此時NK細(xì)胞對其殺傷效率較高。
　　結(jié)