Tims家族蛋白和Tim-3-Galectin-9信號(hào)通路在血吸蟲感染小鼠Th1-Th2細(xì)胞免疫偏移中的作用.pdf

1、目的:
　　血吸蟲病目前仍然是世界上影響范圍最廣、危害最大的寄生蟲病之一,主要在發(fā)展中國(guó)家和經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)流行。該病最嚴(yán)重的后果是針對(duì)血吸蟲蟲卵引起的免疫變異反應(yīng),而其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。本文旨在研究新近發(fā)現(xiàn)的蛋白基因家族和分子通路在血吸蟲病發(fā)生發(fā)展中的作用以及對(duì)日本血吸蟲感染宿主后體內(nèi)免疫偏移(immune deviation)的影響及其與感染過程中免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系。
　　方法:
　　血吸蟲病蟲卵肉芽腫和肝臟纖維化小

2、鼠模型建立后,按實(shí)驗(yàn)要求取各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟制成石蠟切片,用HE染色方法觀察不同感染階段肝臟組織病理變化和免疫組化染色方法觀察Tims蛋白的表達(dá)情況。
　　分別取各實(shí)驗(yàn)組感染小鼠和正常對(duì)照小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng),收集上清采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和 IL-4的表達(dá)量;部分細(xì)胞以RT-PCR半定量方法檢測(cè)Tims蛋白在各感染階段的表達(dá)量,再分別與細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　部分細(xì)胞與PBS/Tim-3融合蛋

3、白孵育后進(jìn)行熒光染色,用流式細(xì)胞分選術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測(cè)T細(xì)胞亞群及其Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá),進(jìn)一步觀察小鼠體內(nèi)Th1/Th2免疫偏移和Tim-3-Galectin-9信號(hào)通路對(duì)于血吸蟲感染后宿主體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　取正常對(duì)照小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,分別用不同抗原蛋白刺激培養(yǎng)后再與Galectin-9蛋白共孵育,收集細(xì)胞以An

4、nexin V-FITC試劑盒染色,分別用FACS和熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;收集細(xì)胞上清用ELISA法檢測(cè)IFN-γ,IL-4的表達(dá)情況,從而觀察體外實(shí)驗(yàn)中Tim-3-Galectin-9信號(hào)通路對(duì)Th1細(xì)胞的促凋亡作用和對(duì)Th1型免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:
　　在感染各個(gè)階段,ELISA方法檢測(cè)IL-4的表達(dá)與RT-PCR半定量檢測(cè)的Tim-2成負(fù)性相關(guān),而IFN-γ的表達(dá)與Tim-3則無明顯相關(guān)性;感染后期

5、(9w)HE染色和免疫組化結(jié)果可看出肝組織肉芽腫出現(xiàn)逐漸纖維化的情況,Tims蛋白在蟲卵表面和內(nèi)部深染,而同期的Tims蛋白含量在逐漸升高;熒光抗體染色后用FACS檢測(cè)得出各個(gè)感染階段的Th1和Th2細(xì)胞亞群的比例和細(xì)胞因子的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以Tim-3-Fc刺激后,CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例明顯升高;體外細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,FACS和熒光顯微鏡結(jié)果都顯示出,Tim-3與Galectin-9結(jié)合后會(huì)促進(jìn)Th1細(xì)胞的凋亡以及IFN-γ表達(dá)的

6、減少,而對(duì)于Th2細(xì)胞以及Th2型細(xì)胞因子的影響并不十分明顯。
　　結(jié)論:
　　本研究構(gòu)建了血吸蟲病蟲卵肉芽腫和肝臟纖維化小鼠模型,并觀察到在血吸蟲感染過程中,Tims蛋白在宿主和血吸蟲卵及毛蚴中都有表達(dá),提示該蛋白家族可能在血吸蟲與人類具有高度的同源基因;研究結(jié)果表明,血吸蟲感染后逐漸偏離為Th2細(xì)胞介導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,其機(jī)制可能與Tim-3-Galectin-9信號(hào)通路介導(dǎo)的促Th1細(xì)胞凋亡有關(guān),從而使得Th1型細(xì)胞因子的分