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文檔簡介
1、一.研究背景
支氣管哮喘(簡稱哮喘)目前在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率,并呈逐漸上升的趨勢,是當(dāng)今世界威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病,是發(fā)達(dá)國家中兒童支氣管疾病發(fā)病率最高的一種。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的報(bào)告指出,目前全球約有3億哮喘患者,其所造成的社會(huì)負(fù)擔(dān)超過了結(jié)核病和艾滋病的總和。我國的哮喘患者已達(dá)3000萬以上,其死亡率位列全球第一。因此,支氣管哮喘已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)亟待解決的公共衛(wèi)生難題。
哮喘是
2、由免疫、遺傳和環(huán)境等多重因素共同作用的結(jié)果,其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。既往的研究多集中在Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。近幾年,隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,哮喘遺傳病因?qū)W成為研究的熱點(diǎn)。對哮喘遺傳機(jī)制及其相關(guān)基因研究已逐步深入,并證實(shí)哮喘是一種多基因遺傳病。目前報(bào)道已有超過100個(gè)基因與哮喘發(fā)病相關(guān),如5q31、6p21上的MHC分子,7q、14q上的T細(xì)胞受體基因,11q12、11q13、12q13-24、13q14、20p1
3、3等。
10號染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome 10,PTEN)是1997年由Steck等3個(gè)研究小組先后發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因,是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因定位于10q23.3上,全長200kb,包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,編碼由403個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)蛋白,相對
4、分子量為50000。PTEN基因主要通過磷酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol(-)3-kinase,PI3K/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)性調(diào)控,對細(xì)胞增殖、生長、凋亡、黏附、遷移和血管生長等進(jìn)行調(diào)節(jié),在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起重要作用。目前除第9外顯子未發(fā)現(xiàn)有基因突變,其余8個(gè)外顯子均發(fā)現(xiàn)有突變,其中第5、第8外顯子有較高的突變率。PTEN基因是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因。目前已在
5、惡性膠質(zhì)瘤、原發(fā)性乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤中證實(shí)了存在這種基因的表達(dá)異常。PTEN基因及其調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常涉及多個(gè)系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,因而研究PTEN基因及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可為治療疾病新策略研發(fā)提供一定理論依據(jù)。
近年,PTEN基因在過敏性氣道炎癥中的作用也越來越受到關(guān)注。韓國學(xué)者Yong等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究首次報(bào)道了PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞(eosinophils,EO
6、S)脫顆粒和活化,降低IL-4、IL-5的濃度,從而減輕嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和氣道高反應(yīng)性。Lee等研究提示,PTEN可通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),減輕氣道炎癥和炎性滲出。Adachi等發(fā)現(xiàn),PTEN基因在過敏性炎癥反應(yīng)中通過嗜酸粒細(xì)胞存活和趨化的負(fù)向調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。近年國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTEN對肺組織干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡及分化也起重要作用,可對肺損傷起保護(hù)作用
7、。國內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),氣道上皮細(xì)胞是PTEN主要表達(dá)細(xì)胞,哮喘大鼠PTEN蛋白表達(dá)明顯減少,PTEN可減少Th2細(xì)胞因子的表達(dá),從而影響Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀態(tài);研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可通過上調(diào)PTEN的表達(dá)而控制哮喘發(fā)作,這可能為地塞米松抑制哮喘氣道炎癥形成的重要作用機(jī)制。多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),上調(diào)PTEN表達(dá)能有效抑制人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖,可能主要是通過抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而起作用的。目前國內(nèi)外對于PTEN基因突變與支
8、氣管哮喘的相關(guān)性研究報(bào)道較少。
嗜酸粒細(xì)胞的浸潤是支氣管哮喘的重要特征,嗜酸粒細(xì)胞是變應(yīng)性疾病中最活躍的一類細(xì)胞。速發(fā)型變應(yīng)性疾病的組織和器官的局部以及滲出液中均有大量的嗜酸粒細(xì)胞浸潤,這是變應(yīng)性發(fā)作的一個(gè)重要特征。嗜酸粒細(xì)胞的聚集和活化是支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的中心環(huán)節(jié)。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過剔除嗜酸粒細(xì)胞基因及人體實(shí)驗(yàn)通過使用抗IL-5單抗,使嗜酸粒細(xì)胞缺失,均證實(shí)了嗜酸粒細(xì)胞活化在哮喘的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。嗜酸粒細(xì)胞在Th2類
9、細(xì)胞參與的氣道過敏性炎癥中也起發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。它對于哮喘的發(fā)作、預(yù)后的判斷和藥物療效的評價(jià)有重要作用,因此嗜酸粒細(xì)胞已經(jīng)成為哮喘治療的一個(gè)有力的標(biāo)靶。
主要由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)等炎癥細(xì)胞參與的慢性過敏性氣道炎癥是支氣管哮喘的主要特征之一。CD4+T細(xì)胞(即Th細(xì)胞)是T細(xì)胞的一種重要細(xì)胞亞群,是哮喘發(fā)生和發(fā)展過程中最重要的調(diào)控者。未致敏的CD4+T細(xì)胞(Th0細(xì)胞)在受到抗原刺激后主要分化為Th
10、1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群。正常人Th1/Th2類細(xì)胞因子互相依存和制約,保持動(dòng)態(tài)平衡。近年來由學(xué)者提出了Th1/Th2類細(xì)胞因子失衡學(xué)說,即Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào),機(jī)體正常的免疫耐受功能受損,從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞及其成分對機(jī)體自身組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞,是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。Th2類細(xì)胞主要通過分泌Th2類細(xì)胞因子而發(fā)揮致病作用。Th2類細(xì)胞因子,以IL-4、IL-5為代表,對血漿IgE水平升高、趨化因子分泌過多、氣道嗜酸粒細(xì)胞增多、氣道平
11、滑肌增生肥大、黏液分泌增多等均起關(guān)鍵作用。Th1類細(xì)胞則主要通過分泌干擾素(IFN-γ)減輕氣道過敏性炎癥,對哮喘的發(fā)病起保護(hù)防御作用。IL-4,又稱B細(xì)胞刺激因子1,是主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子。是一種多功能的炎性介質(zhì),在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重大作用。IL-5是是調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞功能最主要的調(diào)節(jié)因子,它與支氣管哮喘發(fā)作時(shí)嗜酸粒細(xì)胞反應(yīng)有直接的關(guān)系,它在嗜酸粒細(xì)胞的募集、活化、趨化及增殖等方面起著重要作用,對過敏反應(yīng)進(jìn)程起到關(guān)鍵作用。
12、IFN-γ是Th1細(xì)胞因子的典型代表,具有調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞的活化、分化和募集的作用,有利于Th1細(xì)胞的分化,而抑制Th2細(xì)胞的分化,使Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群達(dá)到平衡狀態(tài),從而使哮喘患者的氣道炎癥得到控制。
二.研究目的
本實(shí)驗(yàn)擬探討PTEN基因突變與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性,以及其與嗜酸粒細(xì)胞的關(guān)系,Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中的作用,從遺傳學(xué)和免疫學(xué)角度分析哮喘的發(fā)病機(jī)制,為尋找抑制氣道嗜酸性
13、粒細(xì)胞性炎癥的藥物、免疫學(xué)療法及基因治療靶點(diǎn)提供理論和初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
三.材料與方法
1、研究對象及分組
(1)哮喘組:2010年4月到2011年8月于本院門診隨診的30例哮喘患兒(臨床緩解期),男15例,女15例;年齡2-12歲,平均4.3±2.1歲。均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)。
(2)對照組:2010年4月到2011年8月于本院健康體
14、檢兒童30例,男16例,女14例;年齡2-12歲,平均4.5±2.3歲。均無過敏性疾病病史。
(3)兩組兒童入組前一周均無使用激素及急性感染病史。組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組家長均知情同意參加該項(xiàng)研究。
2、標(biāo)本采集
哮喘組及對照組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血3ml,其中1ml提取全基因組DNA,-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z;其余做血涂片后制備血清,室溫(20~25℃)放置60min,200
15、0r/min離心10min,留取血清-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。
3、應(yīng)用DNA測序法檢測PTEN基因第5、第8外顯子的基因序列
(1)采用苯酚/氯仿提取法提取全基因組DNA。
(2)設(shè)計(jì)PTEN基因exon-8及exon-5特異引物。
(3)應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
(4)應(yīng)用DNA測序儀對哮喘組和對照組標(biāo)本均進(jìn)行PTEN基因測序。
(5)利用DNASI
16、S MAX V3.0軟件對DNA序列測定結(jié)果進(jìn)行分析。
4、細(xì)胞因子檢測:
采用ELISA法測定哮喘組及對照組血清標(biāo)本IL-4、IL-5、IFN-γ。
5、嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù):
將哮喘組及對照組外周血涂片在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上于400倍高倍鏡下進(jìn)行EOS計(jì)數(shù)。
6、數(shù)據(jù)分析
檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)及Wilcoxon秩和檢驗(yàn),用S
17、PSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05作為差異有顯著意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
四.結(jié)果
1、PTEN基因exon-8及exon-5突變分析
哮喘組和對照組PTEN基因第5外顯子和第8外顯子均未發(fā)現(xiàn)基因突變。
哮喘組PTEN基因第8內(nèi)含子的第32個(gè)堿基發(fā)生突變T→G,突變率為86.7%(26/30)。對照組未發(fā)現(xiàn)基因突變。
2、外周血涂片嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果
18、 哮喘組外周血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)420±126(×106/L)顯著高于對照組165±74(×106/L),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.538,P<0.001)。
哮喘患兒中,根據(jù)有無發(fā)生PTEN基因第8內(nèi)含子突變,分為基因突變組(男性12例,女性14例,平均年齡4.2±1.5歲)和基因正常組(男性3例,女性1例,平均年齡5.3±4.7歲),PTEN基因發(fā)生突變的哮喘患兒外周血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于無突變的哮喘兒童,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意
19、義(W=25.500,P=0.026)。
3、血清細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ水平檢測結(jié)果
哮喘組與對照組比較,IL.-4水平158.23±28.76(ng/L)高于對照組70.16±15.35(ng/L),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.794,P<0.001)。
哮喘組與對照組比較,IL-5水平45.32±12.15(ng/L)高于對照組27.58±7.34(ng/L),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意
20、義(t=6.842,P<0.001)。
哮喘組與對照組比較,IFN-γ水平32.21±6.25(ng/L)低于正常對照組53.65±13.19(ng/L),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.047,P<0.001)。
五.結(jié)論
本課題通過基因測序、外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清細(xì)胞因子檢測等技術(shù),研究了PTEN基因突變與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性,其與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系,以及IL-4、IL-5、IFN-γ在哮喘發(fā)
21、病中的作用。通過研究我們得到以下結(jié)論:
1、哮喘兒童的PTEN基因第8外顯子無基因突變,但第8內(nèi)含子存在具有顯著意義的點(diǎn)突變:第32個(gè)堿基突變(T→G),突變率高達(dá)86.7%;
2、哮喘組兒童外周血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高;
3、PTEN基因發(fā)生突變的哮喘患兒外周血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于無突變的哮喘兒童;
4、哮喘兒童PTEN基因第5外顯子未發(fā)現(xiàn)突變;
5、哮喘兒童存在Th
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