Tim-3對(duì)鼠源性巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4-LPS信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：炎癥性腸病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。Tim-3是2001年發(fā)現(xiàn)的TIM家族中的重要一員，有研究表明IBD中Tim-3表達(dá)異常。TLRs信號(hào)通路作為連接固有免疫及適應(yīng)性免疫的橋梁，既是機(jī)體防御病原體入侵的重要門戶，又是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)閘門，大量文獻(xiàn)報(bào)道已確認(rèn)TLRs信號(hào)通路異常在IBD發(fā)病中起重要作用。近年來(lái)有研究顯示Tim-3和TLR4信號(hào)通路在免疫相關(guān)疾病中可互為調(diào)控，但目前尚未見(jiàn)兩者在IBD中共同發(fā)揮作

2、用的報(bào)道。我們的前期研究顯示，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎鼠模型中TLR4信號(hào)通路過(guò)度激活，用Tim-3單抗處理后可使腸粘膜中Tim-3表達(dá)上調(diào)，TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵分子MyD88表達(dá)下調(diào)，提示Tim-3與TLR4均參與IBD的發(fā)生發(fā)展。本文旨在體外采用Tim-3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7，明確Tim-3對(duì)巨噬細(xì)胞中TLR4/LPS信號(hào)通路是否有影響，探討Tim-3及TLR4/LPS信號(hào)通路在IBD中的作用。
　　方法：①培養(yǎng)

3、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，給予不同濃度LPS分別作用6h、12h后收集細(xì)胞（重復(fù)3次）。②采用陽(yáng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，觀察有無(wú)熒光及熒光強(qiáng)度，并收集細(xì)胞檢測(cè)Tim-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平(重復(fù)3次）。③Tim-3過(guò)表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4/LPS信號(hào)通路及促炎因子分泌的影響。實(shí)驗(yàn)分組：未轉(zhuǎn)染組:未轉(zhuǎn)染的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7?？召|(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒

4、的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7。Tim-3質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染Tim-3質(zhì)粒的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7。上述各組再分為L(zhǎng)PS作用與無(wú)LPS作用兩組，選擇LPS作用的最佳濃度和時(shí)間點(diǎn)(1ug/ml，6h)，6h后收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清（重復(fù)4次）。④檢測(cè)方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Tim-3、TLR4、MyD88 mRNA的表達(dá)；免疫印跡方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Tim-3、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)；固相多重雙抗夾心

5、ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量。
　　結(jié)果：⑴不同濃度LPS作用巨噬細(xì)胞6h，在0-1ug/ml濃度范圍內(nèi)，巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88、Tim-3 mRNA表達(dá)隨LPS濃度升高而增加，其中1ug/ml LPS組顯著高于其他濃度組（P＜0.05）。作用12h，100ng/ml LPS組TLR4 mRNA的表達(dá)顯著高于其他濃度組(P＜0.05)，而各組間MyD88、Tim-3 mRNA表達(dá)無(wú)

6、顯著性差異（P＞0.05）。⑵LPS作用巨噬細(xì)胞不同時(shí)間，在0-1ug/ml濃度范圍內(nèi)，6h組TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)均高于12h組，其中1ug/ml LPS作用6h組顯著高于對(duì)應(yīng)的12h組(P＜0.05)。此外，1ug/ml LPS作用6h組Tim-3 mRNA表達(dá)也顯著高于對(duì)應(yīng)的12h組（P＜0.05）。⑶成功構(gòu)建pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3重組表達(dá)質(zhì)粒，酶切后電泳顯示兩條帶，其分子量大小與預(yù)期相一致。測(cè)

7、序分析顯示插入片段與PubMed基因文庫(kù)(GenBank Accession: AF450241.1)中的Tim-3基因序列相似性為100％。⑷Tim-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光。細(xì)胞內(nèi)Tim-3 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。⑸無(wú)論有無(wú)LPS作用，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞內(nèi)Tim-3 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組(P＜0.05，P＜0.01)。

8、同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05）。⑹在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組(P＜0.05);而在無(wú)LPS作用組，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05）。⑺在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞內(nèi)My

9、D88蛋白表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組(P＜0.05);而在無(wú)LPS作用組，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組MyD88蛋白的表達(dá)均高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組，其中未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染Tim-3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。⑻在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組(P＜0.05);而在無(wú)LPS作用組，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組間無(wú)顯著性差

10、異（P＞0.05）。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組pNF-κB p65蛋白的表達(dá)均顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05)。⑼在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量顯著高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組（P＜0.05）;而在無(wú)LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3對(duì)TNF-α的含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組TNF-α的含量均顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05)。⑽

11、在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01);而在無(wú)LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3對(duì)IL-6的含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組IL-6的含量均顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05，P＜0.01)。⑾在LPS作用組，轉(zhuǎn)染Tim-3的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量高于未轉(zhuǎn)染Tim-3組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;在無(wú)LPS作用組，

12、轉(zhuǎn)染Tim-3對(duì)IFN-γ的含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。同時(shí)，無(wú)論有無(wú)轉(zhuǎn)染Tim-3，LPS作用組IFN-γ的含量均顯著高于對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用組(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結(jié)論：①LPS可激活小鼠巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路及上調(diào)Tim-3的表達(dá)，促進(jìn)促炎因子分泌，且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。②在無(wú)其它因素作用下，Tim-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路及促炎因子分泌無(wú)明顯影響。③在LPS作用下，Tim-3過(guò)表達(dá)可