雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性檢測.pdf

1、目的:
　　將兩種抗菌肽優(yōu)化后的基因片段進(jìn)行拼接，通過構(gòu)建攜帶融合基因的表達(dá)載體pPICZα A-cp1-ds4并在畢赤酵母X-33中高效分泌表達(dá)，并研究雜合抗菌肽Cecropinp1-Dermaseptin S4的抗菌活性、穩(wěn)定性及抗腫瘤活性。
　　方法:
　　1.將兩種抗菌肽氨基酸序列組合在一起利用Antheprot release5.0預(yù)測雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級結(jié)構(gòu)，

2、利用The antimicrobial peptidesdatabases(APD)預(yù)測雜合抗菌肽的理化性質(zhì)及成為抗菌肽的可能性。
　　2.抗菌肽Dermaseptin S4基因的克隆:根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性和Genbank中Dermaseptin S4的氨基酸序列以及部分Cecropin P1 C-末端的部分氨基酸序列，設(shè)計適當(dāng)?shù)钠唇右锿ㄟ^重疊延伸PCR(SOE-PCR)進(jìn)行拼接，將拼接產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌DH5α后測序。
　　3.雜合抗菌肽基因的克隆:分別以保存Cecropin P1和Dermaseptin S4正確序列的pPICZα A-cp1和pMD18T-ds4質(zhì)粒為模板，以各自特異性引物為引物進(jìn)行PCR擴增后通過SOE-PCR拼接兩基因片段，將拼接片段克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測序。
　　4.表達(dá)載體pPICZα-cp1-ds4的構(gòu)建:重組質(zhì)粒pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα

4、-A分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測序。
　　5.重組酵母菌pPICαA-cp1-ds4/X-33的構(gòu)建:將表達(dá)載體pMD18T-cp1-ds4經(jīng)SacⅠ線性化后，采用EMC830電穿孔儀低電壓模式電轉(zhuǎn)化酵母并利用100mg/L Zeocin進(jìn)行篩選。
　　6.重組子誘導(dǎo)表達(dá)及初步活性檢測:采用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基以0.5％(v/v)甲醇濃度進(jìn)行培養(yǎng)，利用Tr

5、icine-SDS-PAGE檢測目的多肽的表達(dá)并采用瓊脂擴散法檢測濃縮上清中雜合抗菌肽Cecropin P1-DermasePtin S4的抗菌活性。
　　7.表達(dá)產(chǎn)物的純化:通過提高Zeocin的濃度篩選多拷貝酵母重組子，利用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。
　　8.抗菌譜及最小抑菌濃度測定:分別采用瓊脂擴散法和微量稀釋法測定雜合抗菌肽Cecropin Pi-Dermaseptin S4

6、的抗菌譜及最小抑菌濃度。
　　9.采用Hultmark等通過計算抗菌活力來表征抗菌肽的抑菌能力的方法衡量雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin.S4的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及胰酶消化穩(wěn)定性。
　　10.采用MTT法來研究雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4作用于小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的效果。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)Antheprot release5.0預(yù)測雜合抗菌肽C

7、ecropin P1-Dermaseptin S4的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)雜合多肽依然能夠保持N-末端和C-末端為雙螺旋結(jié)構(gòu)，兩螺旋結(jié)構(gòu)之間存在疏松了連接片段，經(jīng)APD預(yù)測雜合抗菌肽有成為抗菌肽的可能。
　　2.經(jīng)SOE-PCR成功將拼接引物拼接成Dermaseptin S4基因，大小約120bp，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測序，測序結(jié)果顯示序列與設(shè)計序列一致。
　　3.經(jīng)SOE-PCR成功將Cecropin

8、 P1和Dermaseptin S4基因片段拼接后，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測序，測序結(jié)果顯示序列與設(shè)計序列一致。
　　4.pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα-A經(jīng)雙酶切、酶連反應(yīng)后，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測序，測序結(jié)果顯示開放閱讀框完全正確，所編碼的氨基酸序列與設(shè)計一致。
　　5.表達(dá)載體pPICα A-cp1-ds4經(jīng)SacⅠ線性化后在ECM830低電壓模式（電壓為

9、350 V，脈沖時間15s，脈沖次數(shù)1次）下可成功電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，用Zeocin篩選得到陽性重組子。
　　6.瓊脂擴散法初步檢測對大腸埃希菌和經(jīng)黃色葡萄球菌的作用效果，加入濃縮表達(dá)上清均有抑菌環(huán)形成。
　　7.提高Zeocin濃度篩選多拷貝重組子，結(jié)果得到的菌株對Zeocin最大的耐受濃度為400mg/L，用多拷貝重組子表達(dá)目的多肽其產(chǎn)量約為30mg/L，經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后可得一特異性蛋白條帶。
　　

10、8.抗菌譜測定實驗中對選取的大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌SDCDC563、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50222均有抑制作用其最小抑菌濃度分別約為37.5μ g/ml、75ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、150ug/ml、150ug/ml，對銅綠假單孢菌27853無效。
　　9.對雜合抗菌肽進(jìn)行熱、酸堿和胰酶消化后仍能保持較高的抑菌活力。
　　10.通過MTT實驗，雜合抗菌肽對