人源及雜合抗菌肽在乳酸乳球菌中重組分泌表達(dá).pdf

1、背景：
　　目前，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的抗生素耐藥率及耐藥譜正得到快速增加和擴(kuò)展，現(xiàn)有的基于微生物種間作用產(chǎn)生的抗生素類抗菌藥物將面臨前所未有的危機(jī)[1]。另外腸道菌群平衡與人體健康有著密切關(guān)系，當(dāng)菌群失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致宿主多種疾病的發(fā)生，尤其是腸道疾病，如腹瀉、IBD等[2]。抗菌肽(Antibacterialpeptides)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼

2、經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細(xì)胞等活性作用的多肽，但對(duì)于人體有益菌則無明顯抑菌效果。它作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分，同時(shí)因其廣譜抑菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性的特性，可能成為一種新的控制感染和調(diào)節(jié)腸道菌群的有效途徑[3]。如今已確認(rèn)被收錄入數(shù)據(jù)庫(kù)的抗菌肽數(shù)目就達(dá)到1500多種，種類來源包括細(xì)菌、植物、昆蟲、兩棲動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物等[4]。對(duì)于人類本身也有自身分泌的抗菌肽，目前人源類抗菌肽研究較多

3、、作用效果廣泛的有兩大家族，分別是cathelicidins家族和defensins家族。
　　LL-37是迄今為止在人體中發(fā)現(xiàn)的唯一一種Cathelicidins家族抗菌肽，廣泛存在于胃腸道和泌尿道、呼吸道等組織上皮細(xì)胞分泌的中性粒細(xì)胞中，在組織受到炎癥、感染和損傷時(shí)LL-37分泌明顯增加[5]。LL-37具有廣譜抗菌活性，對(duì)多種革蘭陽性菌、陰性菌以及真菌均有效，同時(shí)LL-37作為免疫調(diào)節(jié)因子可通過角質(zhì)細(xì)胞釋放IL-8來影響宿主

4、炎癥應(yīng)答[6]。人α防御素5(alpha human defensin-5，簡(jiǎn)稱HD5)是防御素家族中一個(gè)重要的抗菌肽，它主要在小腸潘氏細(xì)胞中大量分泌表達(dá)，可隨著腸道中受到炎癥、感染和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等因素的刺激而上調(diào)分泌表達(dá)[7，8]。HD5不僅具有高效的廣譜抑殺病原菌活性和能在免疫調(diào)節(jié)起到保護(hù)作用，還可以抗HIV、HSV等病毒作用[9-12]。鑒于抗菌肽的多種活性功能，在研發(fā)新型抗菌藥物及協(xié)同調(diào)節(jié)免疫方面得到了更多的關(guān)注。
　　現(xiàn)

5、今，抗菌肽主要從天然資源中提取，但成本高、得率低、工序繁瑣等制約著其廣泛應(yīng)用;而化學(xué)合成法則價(jià)格相對(duì)昂貴，也難以應(yīng)用于臨床。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽則具有重要意義。乳酸菌作為與人類生活緊密相關(guān)的益生菌，被公認(rèn)為安全的食品級(jí)微生物(generally regarded as safe，GRAS)[13]。它不僅能抑制有害菌生長(zhǎng)，也能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成，改善胃腸道功能，治療胃腸道疾病。本實(shí)驗(yàn)選用乳酸乳球菌中nisin(乳鏈菌肽)調(diào)控表達(dá)系

6、統(tǒng)(nisin-controlledgene expression，NICE)[14]，它是乳酸菌中應(yīng)用最廣泛、可控性最強(qiáng)的表達(dá)系統(tǒng)。通過乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)和SOE(gene splicing by overlap extension)人工合成目的抗菌肽基因獲得人源和雜合抗菌肽的蛋白分泌表達(dá)，研究其體外抗菌活性，同時(shí)體現(xiàn)益生菌和抗菌肽的協(xié)同作用，為后續(xù)動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1、根據(jù)天然人源抗菌肽LL-37和H

7、D5的基因序列設(shè)計(jì)活性更好的雜合抗菌肽LLD1和LLD2。
　　2、體外拼裝合成四條抗菌肽LL-37、HD5、LLD1和LLD2，并構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp-LL37/HD5/LLD1/LLD2，最終在乳酸乳球菌NZ9000中分泌表達(dá)。
　　方法：
　　1、選取抗菌肽LL-37與抗菌肽HD5作為雜合設(shè)計(jì)的藍(lán)本，在GenBank中找到此兩條抗菌肽的基因序列，根據(jù)乳酸乳球菌的偏愛密碼子從新優(yōu)化它們的基因序

8、列，以使其能在乳酸乳球菌中更好的表達(dá)。最終設(shè)計(jì)了兩條雜合抗菌肽LLD1和LLD2的基因序列，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)此總共四條抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、兩親性、等電點(diǎn)、跨膜區(qū)域等方面進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，從中比較它們之間的抗菌活性。
　　2、根據(jù)乳酸乳球菌表達(dá)偏愛密碼子的數(shù)據(jù)庫(kù)，得到優(yōu)化后的四條抗菌肽基因序列。分別將每條抗菌肽的基因全序列分為4段，設(shè)計(jì)成具有18-20bp的重疊引物，利用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增合成抗菌肽基因全序列，并在基因序列兩端引

9、入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpn I和Xba I。最后將合成的四條抗菌肽基因分別與質(zhì)粒pMD19-T simple連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中。得到陽性克隆子后，提取質(zhì)粒，用雙酶切鑒定法和基因測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3、將驗(yàn)證正確的四種抗菌肽重組子進(jìn)行雙酶切，切膠回收抗菌肽基因序列片段，與分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp質(zhì)粒連接，電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌NZ9000中，構(gòu)建四種重組乳酸菌。通過菌液PCR法、雙酶切法和基

10、因測(cè)序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。挑取驗(yàn)證正確的重組乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過nisin誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，四種抗菌肽分別得到分泌表達(dá)，通過Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳、Western Blot和DotBlot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。利用截留分子量為30KD和1KD的超濾離心管分步進(jìn)行超濾離心濃縮上清表達(dá)產(chǎn)物，得到較為純化的上清液進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、我們通過乳酸乳球菌的偏愛密碼子，重新設(shè)計(jì)抗菌肽LL-37和HD5的基因序列，并以此為母本

11、，雜合設(shè)計(jì)出兩條新的抗菌肽LLD1和LLD2。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，抗菌肽LLD1、LLD2、HD5、LL-37都屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的陽離子型抗菌肽，它們的C-端都具有兩親性。兩親性表現(xiàn)明顯的抗菌肽LLD2，它的C端疏水性最強(qiáng)。四條抗菌肽均沒有沒有明顯的跨膜螺旋區(qū)域，意味著它們也許并不是傳統(tǒng)意義的跨膜蛋白，其作用機(jī)制可能與通過靜電引力與細(xì)胞膜相結(jié)合，進(jìn)而形成穿膜孔洞相關(guān)。經(jīng)過一系列分析后，整體來講，經(jīng)過雜合的抗菌肽LLD2可能比其它三條

12、抗菌肽的抗菌活性更強(qiáng)。
　　2、利用設(shè)計(jì)合成好的互補(bǔ)引物，通過重疊延伸PCR成功合成目的抗菌肽基因的全長(zhǎng)序列。本實(shí)驗(yàn)合成抗菌肽LLD1基因全長(zhǎng)為100bp，LLD2基因全長(zhǎng)為112bp，HD5基因全長(zhǎng)為115bp，LL37基因全長(zhǎng)為130bp，經(jīng)電泳結(jié)果分析，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。經(jīng)過雙酶切鑒定和基因測(cè)序均顯示驗(yàn)證正確。表明已成功克隆LLD1、LLD2、HD5和LL37四條目的片段，將該重組質(zhì)粒分別命名為pMD19Ts-LLD1

13、、pMD19Ts-LLD2、pMD19Ts-HD5和pMD19Ts-LL37。
　　3、經(jīng)過菌液PCR驗(yàn)證，四條目的載體pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37的預(yù)計(jì)合成片段大小分別為400bp，412bp，415bp和430bp。在相對(duì)應(yīng)的泳道位置上均可見單一的明亮條帶，并大小一致，說明重組乳酸菌轉(zhuǎn)化成功。根據(jù)雙酶切和基因測(cè)序鑒定結(jié)果，表明重組分泌表達(dá)抗菌肽的乳酸乳球菌構(gòu)建成功。最終得到4種重組乳酸乳球菌，分別

14、命名為NZ9000-SLLD1，NZ9000-SLLD2，NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37。對(duì)四種重組乳酸菌的發(fā)酵上清液分別進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，在3.5-5KDa位置之間均可看到明亮的條帶，與預(yù)計(jì)的抗菌肽蛋白大小一致。并經(jīng)過免疫檢測(cè)，確認(rèn)四種抗菌肽蛋白均得到正確分泌表達(dá)。上清表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過純化濃縮后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，可看到四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。并應(yīng)用不同體積的發(fā)酵上清進(jìn)行獨(dú)立的抑菌試驗(yàn)

15、，發(fā)現(xiàn)當(dāng)上清達(dá)到10mL時(shí)，大腸桿菌會(huì)被基本抑制生長(zhǎng)。但在牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)過程中，抑菌的重現(xiàn)性欠佳，由于選用的人源抗菌肽本身對(duì)益生菌無明顯抑菌作用，因此主要考慮為誘導(dǎo)過程中抗菌肽受到宿主細(xì)胞中蛋白酶的影響及純化條件不足導(dǎo)致蛋白純度和濃度不夠。可進(jìn)一步完善樣品純化工藝，確保檢測(cè)樣品的穩(wěn)定性。
　　結(jié)論：
　　1、為得到抗菌活性更強(qiáng)的抗菌肽以及能更易獲取抗菌肽和讓其更好的針對(duì)人體腸道疾病的治療，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)如何提高抗菌肽活性進(jìn)行了雜

16、合設(shè)計(jì)和一系列的生物信息學(xué)研究，并且利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組益生菌另其得以源源不斷表達(dá)目的抗菌肽。
　　2、本實(shí)驗(yàn)以抗菌肽HD5和LL37為藍(lán)本進(jìn)行雜合，設(shè)計(jì)了雜合抗菌肽LLD1和LLD2。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)四條抗菌肽序列進(jìn)行等電點(diǎn)、兩親性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及跨膜結(jié)構(gòu)等預(yù)測(cè)分析，可以發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LLD1、LLD2、HD5和LL37的等電點(diǎn)都大于7，它們的結(jié)構(gòu)都是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。而且，經(jīng)過雜合后的兩條抗菌肽，尤其是抗菌肽LLD2，具

17、有較母肽HD5和LL37更好的抑菌活性。
　　3、本實(shí)驗(yàn)利用重疊延生PCR法合成四條抗菌肽基因LLD1、LLD2、HD5和LL37，并在pMD19-T simple載體中成功克隆，得到正確的抗菌肽基因序列。
　　4、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37，最終轉(zhuǎn)化到益生菌乳酸乳球菌NZ9000中，成功構(gòu)建了4種轉(zhuǎn)化基因工程菌NZ9000-SLLD1，NZ9000-SLLD2

18、，NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37，并成功進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。將含抗菌肽的發(fā)酵上清進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，可見四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。但由于樣品純化工藝存在不足，抗菌肽的純度和濃度欠佳，抑菌效果并不是十分穩(wěn)定。
　　5、在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，在以下方面還有待進(jìn)一步研究和提高:(1)提高抗菌肽的表達(dá)量和穩(wěn)定性。(2)進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其在腸道菌群中的調(diào)節(jié)作用和對(duì)腸道免疫屏障的防御作用。(3)進(jìn)一步改善抗菌肽基因的設(shè)計(jì)，研